11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因的分子生物学研究

目的利用分子生物学方法,研究7株11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因(cps loci)。方法根据11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因设计合成5对特异性引物,以7株肺炎链球菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定及基因序列比对,确定其血清型。多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术分析7株11群肺炎链球菌序列型(ST)。采用相邻合并分析(neighbour-joining analysis),根据MLST的7个管家基因和cps基因分别绘制系统发育树。结果根据wcw C、gct和wcj E等3个基因产物确定5株原11A型肺炎链球菌为11A型,无11E型;根据wcwR和gct等2个基因产物确定2株原11B型肺炎链球菌为11B型。获得7株不包括4个合成调控基因(wzg、wzh、wzd和wze)的11群肺炎链球菌cps loci,长度为11～12 kb,11A型具有12个开放式阅读框(ORF),11B型具有11个ORF。5株11A型肺炎链球菌部分cps基因序列差异较大; 2株11B型肺炎链球菌部分cps基因序列相似性高于99%。根据MLST分析发现3种新的ST型。根据MLST的7个管家基因绘制的系统发育树和cps基因绘制的系统发育树差异很大。结论从分子水平上确定了11A和11B血清型。获得了5株11A型和2株11B型肺炎链球菌ST型和部分荚膜多糖合成相关基因(cps loci),完善了11群肺炎链球菌的菌种档案。     

儿童感染青霉素耐药肺炎链球菌的 多位点序列分型

目的对儿童感染的青霉素耐药肺炎链球菌进行多位点序列分型,了解厦门地区肺炎链球菌青霉素耐药菌株遗传背景。方法采用多位点序列分型法对2012年1月至2014年12月期间分离的60株青霉素耐药肺炎链球菌进行分子分型。结果 60株青霉素耐药肺炎链球菌MLST法共检出24个ST型,其中发现6个新的ST型,分别被命名为ST10004、ST10005、ST10006、ST10007、ST10008和ST10009。存在一个优势型别ST271,占31.7%(19/60),发现了4个克隆群和20种单一克隆,其中主要克隆群为国际流行耐药克隆群Taiwan19F-14,占41.7%(25/60)。结论本地区分离的儿童青霉素耐药肺炎链球菌主要以ST271型为主,属国际流行耐药克隆群Taiwan19F-14,是引起儿童呼吸道感染肺炎链球菌多重耐药的主要原因。     

应用分子生物学方法鉴定6群肺炎链球菌血清型

目的利用分子生物学方法,鉴定26株6群肺炎链球菌的血清型。方法利用6群肺炎链球菌荚膜多糖相关基因设计合成6对特异性引物,PCR扩增26株肺炎链球菌,并对PCR产物进行基因序列的测定及分析。结果26株肺炎链球菌cpsD蛋白229个氨基酸中有7个突变点,第220~222位均没有缺失;其中,19株肺炎链球菌具有与wci Nα蛋白氨基酸序列完全一致的氨基酸组成,第150位均为Ala,第38位均为Asp,其余7株与wciN_α蛋白氨基酸序列没有相似性,但与wciN_β蛋白氨基酸序列相似性超过99%;15株wciP蛋白第195位为Ser,11株wci P蛋白第195位为Asn。综合分析比对后,26株6群肺炎链球菌中,11株属于6A型肺炎链球菌,8株属于6B型肺炎链球菌,4株属于6C型肺炎链球菌,3株属于6D型肺炎链球菌。结论分子生物学方法可用于6群肺炎链球菌血清型的鉴定,为完善6群肺炎链球菌的菌种档案提供了实验依据。     

19群肺炎链球菌国家标准菌株分子特征分析及在菌株质量控制中的应用

目的明确19群肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)国家标准菌株的分子特征,为完善中国肺炎链球菌国家标准菌株的质量标准提供依据。方法在传统肺炎链球菌菌种检定方法的基础上,应用16S rRNA基因分析、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)血清分型、多位点序列分型(multilocus sequence type,MLST)和脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型等多种分子生物学质控方法,对来源于中国医学细菌保藏管理中心的20株19群肺炎链球菌国家标准菌株进行分析。结果 20株19群肺炎链球菌的16S rRNA基因序列与肺炎链球菌模式株NCTC 7465的16S rRNA基因序列的相似性在99.64%～100%之间,碱基差异0～5 bp。PCR血清分型结果表明:11株19F型菌株均检测到大小为304 bp的19F型特异性扩增条带,6株19A型菌株均检测到大小为478 bp的19A型特异性扩增条带,PCR血清分型结果与血清凝集试验结果一致。MLST分型结果表明,相同血清型的菌株可以具有不同的序列型(sequence type,ST)。共获得12个ST型,其中6个ST型(10496、10497、10501、10502、10503和10509)为首次报道。PFGE分型结果显示:各型别菌株各具有其特征性PFGE带型(9～17条带),相同血清型或ST型菌株可能具有不同的PFGE带型。共存在18种不同的PFGE带型,其中19F型和19A型菌株中各有一对菌株的ST型和PFGE图谱完全一致。菌株的传代稳定性考察结果显示:在25代以内31708菌株的PFGE带型未发生变化,遗传特征是稳定的。结论 16S rRNA基因分析、PCR血清分型、MLST分型和PFGE分型等分子生物学方法应用于中国肺炎链球菌国家标准菌株的质量控制,可获得更加全面的肺炎链球菌标准菌株身份信息数据(包括序列、PCR扩增片段、序列型、图谱等),为进一步完善中国肺炎链球菌国家标准菌株的质量标准提供依据和数据支撑。     

马源马链球菌兽疫亚种3株新疆分离株基因型的鉴定及MLST分析

【背景】马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus,SeZ)是引起马腺疫的主要病原,还可引起猪链球菌病,加强该菌的地方株分子流行病学监测对有效防控相关疫病十分必要。【目的】对新疆地区2个马场SeZ分离株进行鉴定和药敏特性分析,并分析3株新疆分离株的分子流行与菌株的遗传进化特征。【方法】对分离纯化的3株病原菌(ZHZ113、ZHZ211和ZHZ523)进行染色观察、生化及药敏特性检测,对16S rRNA和SeM基因进行遗传进化分析,以链球菌7个管家基因arcC、nrdE、proS、spi、tdk、tpi和yqiL为目的基因对3株分离菌进行多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)研究。【结果】3株SeZ的药敏结果显示这3株分离菌对不同抗生素的耐药程度不同,但均对头孢西丁、庆大霉素、链霉素、红霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、土霉素等11种药物敏感。16SrRNA基因序列分析显示这3株分离菌均属于Ⅱ群(兽疫链球菌)。3株菌的MLST分型结果分别为ST39、ST419、ST421型,其中ST419和ST42...     

海南岛光滑假丝酵母菌多位点序列分型研究

目的:对海南省光滑假丝酵母菌临床分离株进行基因分型研究,了解菌株的遗传特征及遗传进化关系.方法:采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术,对临床分离的25株光滑假丝酵母菌6个管家基因序列进行测定;并将各个基因的序列与MLST数据库中储存的序列比对,确定其等位基因谱型及菌株序列型(STs).结果:25株临床分离的光滑假丝酵母菌通过MLST产生ST7、ST19、ST15、ST26、ST45共5个不同的序列型,其中ST7为主要序列型.结论:海南省光滑假丝酵母菌感染型别丰富,具有多样性;MLST分型具有较高的分辨力,可用于流行病学和菌群多态性的研究.     

47株空肠弯曲菌湖北禽源株的多位点序列分型

【目的】为了解湖北地区家禽空肠弯曲菌的流行状况及其分子特征,应用多位点序列分型方法对2013–2014年的47株禽源空肠弯曲菌湖北分离株进行分子分型研究。【方法】以空肠弯曲菌的7个管家基因aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA为目的基因,提取样本基因组后PCR扩增,测序和分析。将测序结果上传数据库进行比对,制作成多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)遗传进化树。【结果】分离株共有38个ST型,10个克隆群,其中最多的克隆群为ST-353CC和ST-464CC,发现2个新的等位基因编号和25个新的ST型。遗传进化树显示,不同家禽宿主中空肠弯曲菌序列型存在一定的差异,不同地区和来源的空肠弯曲菌呈现出遗传多样性。【结论】本研究对湖北分离的47株禽源空肠弯曲菌进行了MLST分析,其结果显示菌株多样性较为丰富,将为我国家禽空肠弯曲菌的流行病学调查提供科学的数据。     

多位点序列分型技术在热带念珠菌中的应用研究

目的探讨上海瑞金医院临床分离的热带念珠菌MLST (Multilocus sequence types,MLST)型别。方法连续收集上海市瑞金医院临床分离的热带念珠菌菌株,用PCR技术扩增热带念珠菌的6对管家基因,并对扩增片段进行纯化测序后与热带念珠菌MLST数据库比对得到临床菌株的二倍体序列型别DSTs (Diploid sequence types,DSTs),再利用eBURST V3软件对结果进行分析,用MEGA 6.0软件建立系统发育树,最后对部分临床菌株进行药物敏感性实验,探讨菌株耐药与基因型别之间的关系。结果临床分离的92株热带念珠菌分属于47个DSTs,其中15个DSTs是已经报道的,32个DSTs在本次研究中首次得到;DST507和DST376是本次研究中的优势型别,且属于同一个克隆簇。药敏实验显示属于优势型别的27株临床菌株中21株为唑类药物耐药菌株。结论 MLST技术是一种高效的基因分型技术;DST507和DST376是上海瑞金医院热带念珠菌的优势型别;唑类药物耐药菌株表现为DST507和DST376的聚集分布。     

多位点序列分型在食源性金黄色葡萄球菌分型中的应用研究

对食源性金黄色葡萄球菌进行多位点序列分型(MLST)分析,了解其基因型特征,并与流行病学资料进行对比分析。应用MLST方法对2012年石家庄市分离出的18株食源性金葡菌进行基因分型,并对该地区食源性金葡菌分子特性和流行病学特性进行分析。18株食源性金葡菌通过MLST分析得到10个ST序列型,其中ST5序列型最多,共5株;其次为ST464序列型,共3株;ST7型和ST15各2株;ST6型、ST9型、ST59型和ST2138型各1株,有2个菌株是2个新的ST型其ST码分别为287-1-1-8-1-1-1和10-14-8-6-278-3-2。本地区食源性金葡菌的ST型别丰富,主要流行克隆系为ST5和ST464,ST6、ST7、ST9、ST15、ST59和ST2138等克隆系也有分布。     

日化产品中洋葱伯克霍尔德氏菌复合群(Bcc)的分类和神秘伯克霍尔德氏菌的耐药性研究

【目的】对从2020–2022年不同日化产品中分离的29株洋葱伯克霍尔德氏菌复合群(Burkholderia cepacia complex,Bcc)进行分类和分型,另将2020年前来源于日化产品中6株被鉴定为Burkholderia lata的菌株进行分类更正。探究神秘伯克霍尔德氏菌(Burkholderia aenigmatica)的耐药性。【方法】本文主要应用多位点分型研究方法(multilocus sequence typing,MLST),PCR扩增atpD、gltB、gyrB、recA、lepA、phaC和trp B 7个管家基因片段,将测序结果与MLST数据库中的数据比对分析,获得菌株各管家基因的编号和ST型(sequence type),对本检测中心分离自日化产品的Bcc进行分型;利用多位点序列分析(multilocus sequence analysis,MLSA),结合MLST中等位基因的核苷酸序列构建进化树,从而对Bcc进行系统发育分析和鉴定。利用最小抑菌浓度法(minimum inhibitory concentration,MIC)测定Bcc对常见防腐剂(1,...