pEGFP—HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达

应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)的重组融合表达质粒,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析后,用基因转染技术将其导入小鼠肝癌细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段的大小、方向和插入位点均正确,在转染的小鼠肝癌细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。构建的pEGFP-HPV16E7融合表达质粒能直观地反映转染细胞中EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达。由于转化率与表达率融为一体,故有利于对转染细胞的筛选,缩短转染细胞在体外的筛选的时间适用于对：HPV16E7分子生物学特性．致瘤机理及APC提呈等的研究。为建立表达HPV16E7的实体瘤动物模型奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型早期基因E6、E7的克隆及表达

高危人乳头瘤病毒16型的感染与宫颈癌的发病密切相关。HPV16E6和E7蛋白在大多数HPV16相关宫颈癌及其癌前病变中持续表达,因此E6和E7蛋白可作为制备HPV16相关肿瘤及其癌前病变治疗性疫苗的靶抗原〔2〕。采用套式PCR方法,从宫颈癌患者组织中扩增出E6、E7基因并成功构建了包含E6、E7的表达质粒PET-E6、PET-E7。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blotting分析结果表明,外源基因E6,E7在T7启动子控制下可获得稳定表达。     

转染人乳头瘤病毒16型E6E7重组基因及感染模型细胞建立

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是性传播疾病的主要病原之一,高危型人乳头瘤病毒感染和宫颈癌的关系已被肯定[1],在约50%~90%的宫颈癌组织中可检出HPV16 DNA。为了解与HPV相关疾病的的分子生物学致病基础,尚待深入研究其生物特性和病理特征,方能逐步解决临床简便易行的试验诊断方法和抗HPV感染的治疗问题。目前已经证实HPV16 E6/E7基因是转化基因,它们编码的蛋白可分别使抑癌蛋白P53和PRb失活,在宫颈癌的发生中起着重要作用[2],被认为是宫颈癌的始动因子。本文选择HPV16 E6E7作为研究对象,利用基因重组技术构建EGFP-…     

人乳头瘤病毒16型E7基因的克隆和表达

用分子克隆技术在大肠杆菌中表达HPV16 E7基因。用限制性内切酶DdeⅡ将含有大部分E7基因的191bp片段从HPV16基因组中切出。将此片段与含有色氨酸操纵子的启动子的表达载体pATH10连接成重组DNA,用以转化E.coli DH5α,并筛选出阳性重组子。还进行了限制酶酶切分析和蛋白质SDS-PAGE分析。表达的新蛋白质带的分子量与预期的分子量相符。我们认为表达的新蛋白质是TrpE和E7蛋白的融合蛋白。     

表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建

为研制HPV16的治疗性疫苗,首先将表达质粒pJSA1175与非复制型痘苗病毒NTVJTK+进行同源重组,构建了痘苗重组病毒NTVJLac.再将表达质粒pJSDME6E7R与NTVJLac进行同源重组,构建了表达HPV16 E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7,并对获得的重组病毒进行了鉴定.Southern杂交显示,重组痘苗病毒NTVJmE6E7基因组中有E6和E7基因插入.该重组病毒在人源细胞中不复制.Western blot显示,重组病毒在人源TK-143细胞中能表达E6和E7蛋白.非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7可作为HPV16相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的实验性疫苗株.     

腺伴随病毒载体介导HPV16 E6E7基因转化人胎食管上皮细胞

为了证实人乳头瘤病毒16型（HPV16）感染与食管鳞状细胞癌发生的关系,构建了包含HPV16E6E7基因的重组腺伴随病毒载体并包装重组病毒,重组病毒感染人胎食管粘膜组织,注射SCID小鼠皮下,在TPA协同下12周左右诱发肿瘤。PCR及打点杂交检测到瘤组织中HPV16E6E7基因的存在,HE染色表明为恶性鳞状上皮癌,培养形态及透射电镜观察证实了瘤组织的上皮来源。以上结果对于阐明食管癌发生的病毒病因、食管癌发生的分子机制以及为食管癌防治提供了理论和实践依据。     

人乳头瘤病毒16型E7过表达细胞的鉴定及其迁移效应的影响

鉴定人乳头瘤病毒16型早期蛋白7(HPV16E7)过表达细胞及其迁移效应的影响,为后续基于HPV16E7靶向分子作用机制的研究奠定工作基础.脂质体转染法将本室保存的pcDNA3.1-HPV16E7重组真核表达质粒分别转染人胚肾293T细胞(HPV16型DNA阴性)、宫颈癌SiHa细胞株(HPV16 DNA阳性),转染48 h后收集细胞,提取RNA,RT-PCR扩增相应的目的基因,Western Blotting和间接免疫荧光实验检测HPV16E7目的蛋白在细胞中的表达.转染24h的细胞进行细胞划痕和Transwell实验,检测过表达细胞迁移行为的变化.RT-PCR结果显示:分别从E7质粒转染的293T、SiHa细胞的cDNA中,均可扩增到250 bp的目的条带;Western Blotting分析结果显示:以HPV16E7单克隆抗体为检测抗体,转染细胞的裂解液中均能在相对分子质量(Mr)约为15 000处出现特异性目的条带;间接免疫荧光结果显示:转染细胞中均能检测到目的绿色荧光,且分布于胞浆及细胞核周围;细胞划痕和Transwell实验结果显示:转染E7细胞的迁移效应显著提高.本研究证实了 HPV16E7转染细胞后可成功表达,且过表达细胞明显促进了细胞迁移行为,为后续基于HPV16E7迁移相关分子机制及靶向干预等研究奠定了前期工作基础.     

人乳头瘤病毒58型L1基因重组表达载体的构建及鉴定

目的　人乳头瘤病毒 (HPV)是一种能引起人类皮肤、粘膜的乳头状瘤或疣 ,并可导致恶性病变的病原体。研究表明 ,90 %宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒感染有关。近年流行病学研究和文献报道显示 ,HPV5 8型在中国妇女宫颈癌中检出阳性率非常高 ,是仅次于HPV1 6型、1 8型的乳头瘤病毒高发型 ,尤其是东南省份 ,5 8型的感染率有上升趋势 ,与HPV1 6型的检出率相近 ,同时二者在宫颈各病变组的检出强度趋势基本一致。由此可见 ,在我国HPV5 8型感染与宫颈癌关系密切。在HPV5 8基因组中 ,L1和L2基因分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白 ,其中L1基…     

人乳头瘤病毒16型E7密码子优化后的原核表达及免疫原性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因密码子优化后的原核表达系统,通过特异性抗体制备评价E7融合蛋白的免疫原性。方法人工合成优化后的HPV16 E7基因,利用特异引物扩增HPV16 E7基因。将E7基因连接至原核表达载体构建重组表达质粒pMAl-c2X-E7,转化至感受态细胞DE3后,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达产物E7融合蛋白。纯化后的E7融合蛋白免疫动物,采用ELISA检测动物血清效价。结果 E7基因PCR产物的测序结果与优化后的目的基因序列比对一致。表达的E7融合蛋白经SDS-PAGE分析表明:在相对分子质量50 000处有特异性表达带,与预期相符。以E7融合蛋白制备的多克隆抗体其血清效价可达1∶64 000。结论成功构建的重组表达质粒pMAl-c2X-E7可有效表达MBP-E7融合蛋白,E7融合蛋白具有良好的免疫原性。     

聚合酶链反应检测宫颈癌中HPV16E6／E7相关序列

本文报告了采用聚合酶链反应(即PCR技术)检测人宫颈癌中人乳头瘤病毒16型(HPV16)的E_6/E_7相关序列。在正链引物(SP)和反链引物(ASP)的诱导下,以二步温控法聚合酶链反应对34例人宫颈癌组织DNA进行检测,发现宫颈癌中HPV16E_6/E_7相关序列存在的阳性率达67.6％(23/34)。本研究结果提示:HPV16可能在宫颈癌的发生发展过程中起重要作用,采用PCR技术选择性地检测HPV16的转化基因(E_6、E_7)对深入探讨宫颈癌发生的机理、早期发现宫颈癌患者等有重要意义。     

Expression,Polyubiquitination, and Therapeutic Potential of Recombinant E6E7 from HPV16 Antigens Fused to Ubiquitin

Ubiquitin–proteasome system plays an essential role in the immune response due to its involvement in the antigen generation and presentation to CD8⁺ T cells. Hereby, ubiquitin fused to antigens has been explored as an immunotherapeutic strategy that requires the activation of cytotoxic T lymphocytes. Here we propose to apply this ubiquitin fusion approach to a recombinant vaccine against human papillomavirus 16-infected cells. E6E7 multi-epitope antigen was fused genetically at its N- or C-terminal end to ubiquitin and expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. The antigens were solubilized using urea and purified by nickel affinity chromatography in denatured condition. Fusion of ubiquitin to E6E7 resulted in marked polyubiquitination in vitro mainly when fused to the E6E7 N-terminal. When tested in a therapeutic scenario, the fusion of ubiquitin to E6E7 reinforced the anti-tumor protection and increased the E6/E7-specific cellular immune responses. Present results encourage the investigation of the adjuvant potential of the ubiquitin fusion to recombinant vaccines requiring CD8⁺ T cells.     

抗HPV16 E7-ribozyme在CV-1细胞中的稳定表达

构建了由RSV—LTR启动子带动并能在细胞内稳定复制的Ribozyme的自身修剪表达质粒pRSV—Rz523、Ribozyme反义对照质粒pRSV—AE7及人增殖细胞核抗原基因(PCNA)启动子带动的HPVl6 E7片段(+554～+686)的真核表达质粒pPCNA—E7。经G418抗性筛选获得了稳定表达Ribozyme的CV-1细胞克隆,其表达水平约为9．Opmol／lO6个细胞,其中活性Ribozyme的量大于50fmol／lO6个细胞,分离得到的Ribozyme可在体外特异切割E7靶RNA片段。通过共转染Ribozyme(或反义对照)和底物表达质粒并筛选出细胞克隆．研究了Ribozyme在细胞中对底物表达水平的影响。初步结果显示．Rihozyme的导人可使细胞内底物E7的RNA表达水平降低了90％(反义对照使E7 RNA表达降低20％)。上述结果提示：在CV-1细胞中表达的Ribozyme不仅在体外,同时在细胞内具有一定的生物学活性,有可能应用于逆转官颈癌细胞的恶性表型。     

Expression and purification of His-tagged HPV16 E7 protein active in pRb binding

Human papillomavirus type 16 (HPV16) protein E7 is the major oncogenic factor associated with the development of human cervical cancer. The transforming activity of the E7 protein is linked to its interaction with host regulatory proteins such as the retinoblastoma tumor suppressor protein. The recombinant production of E7 protein is a prerequisite for its structural and functional characterization as well as for the development of various preventive and therapeutic strategies. We present an approach to enhance the soluble expression of His-tagged E7 protein by optimization of the E7 gene and the expression conditions in the host Escherichia coli. We also report a detailed protocol for the purification of E7 protein by standard chromatographic methods. The binding of E7 protein to the recombinant non-phosphorylated form of retinoblastoma protein was examined by ELISA and surface plasmon resonance analysis. These studies confirm that the recombinant His-tagged E7 protein retains its conformational properties and biological activity.     

Attenuated Recombinant Influenza A Virus Expressing HPV16 E6 and E7 as a Novel Therapeutic Vaccine Approach

Persistent infection with high-risk human papillomavirus (HPV) types, most often HPV16 and HPV18, causes all cervical and most anal cancers, and a subset of vulvar, vaginal, penile and oropharyngeal carcinomas. Two prophylactic virus-like particle (VLPs)-based vaccines, are available that protect against vaccine type-associated persistent infection and associated disease, yet have no therapeutic effect on existing lesions or infections. We have generated recombinant live-attenuated influenza A viruses expressing the HPV16 oncogenes E6 and E7 as experimental immunotherapeutic vaccine candidates. The influenza A virus life cycle lacks DNA intermediates as important safety feature. Different serotypes were generated to ensure efficient prime and boost immunizations. The immune response to vaccination in C57BL/6 mice was characterized by peptide ELISA and IFN-γ ELISpot, demonstrating induction of cell-mediated immunity to HPV16 E6 and E7 oncoproteins. Prophylactic and therapeutic vaccine efficacy was analyzed in the murine HPV16-positive TC-1 tumor challenge model. Subcutaneous (s.c.) prime and boost vaccinations of mice with recombinant influenza A serotypes H1N1 and H3N2, followed by challenge with TC-1 cells resulted in complete protection or significantly reduced tumor growth as compared to control animals. In a therapeutic setting, s.c. vaccination of mice with established TC-1 tumors decelerated tumor growth and significantly prolonged survival. Importantly, intralesional vaccine administration induced complete tumor regression in 25% of animals, and significantly reduced tumor growth in 50% of mice. These results suggest recombinant E6E7 influenza viruses as a promising new approach for the development of a therapeutic vaccine against HPV-induced disease.     

不同佐剂对人乳头瘤病毒16型L2E7E6蛋白免疫效果的影响

目的:研究CpG佐剂、弗氏佐剂、聚肌胞苷酸佐剂及左旋咪唑、西米替丁作为佐剂对人乳头瘤病毒16型L2E7E6融合蛋白在小鼠体内产生的免疫效果的影响。方法:以单独蛋白组、蛋白加各佐剂组分别肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,检测不同佐剂诱发小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,并观察其对小鼠肿瘤生长的抑制作用。结果:各免疫组均能检测到高滴度的抗L2、E7、E6蛋白IgG抗体(以IgG1为主),其中弗氏佐剂能显著提高E6蛋白的IgG和IgG1抗体水平和E7蛋白的IgG1抗体水平(P<0.05),CpG佐剂明显提高了E7蛋白的IgG2a抗体水平(P<0.01);而西米替丁佐剂则降低了E7抗原的IgG抗体水平(P<0.05);同时可以检测到CpG佐剂组能诱发小鼠产生针对E7、E6较强的细胞免疫反应,且能抑制70%的荷瘤小鼠肿瘤生长;此外弗氏佐剂与聚肌胞苷酸佐剂可产生较弱的针对E7肽的细胞免疫反应,能延缓荷瘤小鼠肿瘤形成时间,与单纯蛋白组相比差异显著(P<0.05)。结论:CpG佐剂、弗氏佐剂和聚肌胞苷酸佐剂都能提高人乳头瘤病毒16型L2E7E6融合蛋白的细胞免疫反应水平和抑制肿瘤生长能力,其中CpG佐剂效果较好,为促进该蛋白作为疫苗的研发提供了实验依据。