庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用PCR扩增出HGV E2全基因,克隆进杆状病毒表达载体pFASTBACHTa中,构建成重组转座载体pFASTBAC-E2,转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得含HGV E2基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Sf9细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ELISA方法检测各类血清标本,初步研究HGV E2糖蛋白的抗原性.     

人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达

诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGII4、GGII1和GGII3等为主要的流行遗传型。为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成。以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型衣壳蛋白基因进行了表达。结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒。重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰。这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础。     

人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达

诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGⅡ4、GGⅡ1和GGⅡ3等为主要的流行遗传型.为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成.以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGⅡ1、GGⅡ3、GGH4和GGⅡ7型衣壳蛋白基因进行了表达.结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒.重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰.这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础.     

用杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达马立克病病毒pp38基因

鸡马立克病病毒(MDV)38kd磷蛋白(pp38)基因中包括起始密码子和终止密码子的完整编码序列被整合进杆状病毒AcNPV的转移载体质粒pVL1392,用所得的含pp38基因的重组转移载体质粒pVLpp38I与野生型杆状病毒AcNPV的DNA共转染昆虫传代细胞系Sf9细胞后,用荧光抗体法以抗MDV单克隆抗体H_(19)筛选到能表达MDVpp38的重组杆状病毒克隆BP38 I。免疫印迹试验表明,在重组病毒BP38 I感染的Sf9细胞溶解物中,可表现一条分子量约为35—36kd的为单克隆抗体H_(19)识别的MDV特异性蛋白带。     

杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因,利用Bac-to-Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示,将带毒Sf9细胞培养上清(1.2×10⁷PFU/mL)用哺乳动物细胞培养基1倍稀释后,37℃下孵育靶细胞12h(moi=50),可达到较高的基因转移及表达效率,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为,经过适当改造后的Bac-to-Bac重组杆状病毒系统可作为一种对哺乳动物细胞简便高效的基因转移表达载体。     

水稻条纹病毒RNA聚合酶在昆虫细胞中的表达

[目的]利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)RNA聚合酶(RdRp)基因。[方法]RT-PCR扩增RdRp基因功能区片段,克隆于转移载体p Fast Bac HTb上,转化到大肠杆菌DH10Bac中,得到重组杆状病毒表达载体Bacmid-rp。提取Bacmid-rp DNA,转染Sf9细胞获得重组病毒v Ac-rp。将重组病毒v Ac-rp感染Sf9细胞使目的蛋白在细胞内表达,并利用亲和层析纯化,SDS-PAGE检测RdRp的表达情况。将纯化的RdRp蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot分析RdRp的免疫原性。[结果]RSV RdRp基因功能区能够在Sf9细胞中表达,蛋白分子量约为45k Da,与预测大小一致,且可与RdRp抗血清发生特异性反应。[结论]在真核细胞中成功表达了RSV RdRp,并得到了纯化的RdRp和其多克隆抗体。     

人骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白在昆虫细胞中的表达和活性分析

目的:利用BaculoDirect杆状病毒表达系统融合表达人OPG功能片段p22-194和分枝杆菌HSP70 p111-125基因,并鉴定重组蛋白及其生物学活性。方法:将编码人OPG功能片段和分枝杆菌HSP70功能片段基因克隆至杆状病毒转座载体,将重组转座载体与BaculoDirectTM Linear DNA进行LR重组连接反应,构建出重组杆状病毒DNA,转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒。在Sf9细胞中进行表达,并对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blotting分析,用Ni柱纯化。采用破骨细胞生成抑制试验和抑炎试验鉴定表达产物的生物学活性。结果:重组病毒在感染昆虫细胞后48h开始出现一相对分子质量为28 kDa大小的特异条带,感染后72～96 h蛋白量达到高峰。破骨细胞生成抑制实验及抑炎试验结果显示,重组蛋白能明显抑制破骨细胞的生长和分化,同时亦具有抑制炎症反应的作用。结论:利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中成功表达OPG-HSP70融合蛋白,该融合蛋白具有抑制破骨细胞生成和抑制炎症反应生物学活性。     

基于猪细小病毒病毒样颗粒的结肠癌靶向纳米载体的构建

【目的】获得具有结肠靶向的纳米载体。【方法】采用SOE-PCR方法将具有结肠靶向的TK肽序列插入到猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2的环2和环4区域得到TK-vp2(?vp2)基因,在Bac-to-Bac?杆状病毒表达系统中构建、表达和自组装。【结果】通过SOE-PCR方法扩增获得?vp2基因,在Bac-to-Bac?杆状病毒表达系统中构建得到Bacmid-?vp2,经脂质体转染至Sf9昆虫细胞得到重组杆状病毒。直接免疫荧光试验、SDS-PAGE和Western blot检测结果表明?VP2蛋白在Bac-to-Bac?杆状病毒表达系统中获得融合表达,目的蛋白约70 k D;透射电子显微镜结果显示?VP2能自组装形成病毒样颗粒(TK-VLPs),直径范围在22 nm-30 nm。【结论】获得纳米载体TK-VLPs,为进一步研究其作为结肠靶向的纳米载体奠定物质基础。     

BJ46a基因在昆虫细胞的转染、蛋白表达及超微结构观察

目的研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a在杆状病毒表达系统的表达及宿主细胞Sf9超微结构的变化。方法将构建的杆状病毒重组穿梭载体Bacmid BJ46a,经Cellfectin脂质体介导转染Sf9昆虫细胞,获重组杆状病毒颗粒;以高滴度病毒感染Sf9昆虫细胞,行Western blot观察BJ46a融合蛋白的表达。在病毒扩增、蛋白表达过程应用透射电镜和超薄切片技术观察Sf9细胞超微结构的变化。结果Western blot分析表明：在转染病毒的Sf9细胞出现BJ46a融合蛋白表达条带。电镜观察表明：Sf9细胞在病毒扩增过程,细胞核增大,病毒发生基质形成,杆状病毒在其周围装配。蛋白表达期间,杆状病毒量剧增,细胞核内外存在大量丝状纤维。结论BJ46a基因可在杆状病毒表达系统成功表达,并伴随着宿主细胞超微结构的显著变化,其结果为杆状病毒表达系统的研究奠定坚实的基础。     

FMDV 3C蛋白酶基因的克隆及在昆虫细胞中的表达

口蹄疫病毒3C蛋白酶在病毒的致病机理、聚蛋白前体的加工和RNA的复制上起着很重要的作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点.本研究从Asia Ⅰ型FMDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增3C基因,首先克隆到pGEM-T载体,再亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBac B中,构建出重组转移载体pMel-3C.最后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了重组杆状病毒.重组病毒经扩增后以10个MOI感染Sf9细胞,接种病毒72 h后收获细胞,样品经SDS-PAGE和Western blot证实3C蛋白获得表达,分子量约23kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别.本研究为空衣壳的体外组装及新型抗病毒药物设计的研究奠定了基础.     

通用真核质粒表达载体的构建

利用真核基因表达调控的原理,以pSV2-dhfr为起始材料,构建了两个通用的真核质粒表达载体pMAML1-dhfr和pMAML2-dhfr,它们包含人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子调控元件,由两个转录方向相同或相反的表达单元组成.以荧火虫荧光素酶基因为报道基因,β-半乳苷酶基因为内对照,借助COS-7短暂表达系统,研究了它们对荧光素酶表达的影响,并比较了它们与出发载体pSV2-dhfr的相对强弱.     

Comparative analysis of various root active promoters by evaluation of GUS expression in transgenic Arabidopsis

To prepare various root active promoters for expressing transgenes and prevent gene silencing caused by the repeated use of the same promoter, the expression characteristics of various root active promoters were comparatively evaluated using GUS as a reporter gene. The high-affinity potassium transporter (HKT1;1), the Shaker family potassium ion channel (SKOR), the Shaker family inward rectifying potassium channel (AKT1), the major facilitator superfamily protein (MFS1), and the senescence associated gene 14 (SAG14) promoter from Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) were used, and for comparison, four additional constitutive or green tissue specific promoters in the expression vectors were also employed. As the Gateway cloning technology provided by Invitrogen can offer high efficiency and cloning reliability, and easy manipulation of fusion constructs in vitro, our expression vectors are based on binary (destination) vectors compatible with this cloning technique. These destination vectors are also advantageous for stable expression of the transgene, as the heat shock protein terminator is utilized. The AtHKT1;1, SKOR, AKT1, MFS1 and SAG14 promoters were all active in roots but showed slightly different tissue specificities: AtHKT1;1, SKOR, and MFS1 were dominantly active in vascular bundle tissue, while AtHKT1;1 and MFS1— but not SKOR, AKT1, and SAG14—were active in root tips. SKOR showed the strongest root-specificity, and SAG14 showed the highest activity among the five root active promoters. The activity of MFS was developmentally regulated. These destination vectors are now available to express multiple transgenes in transgenic plants, especially in roots.     

麦冬OjRCA基因植物表达载体的构建

Rubisco活化酶(RCA)对光合关键酶Rubisco具有重要的调节作用.以植物表达裁体pBI121为基础,设计分别带有酶切位点Sma Ⅰ和Sac Ⅰ的一对特异引物,以麦冬叶片总RNA反转录得到的第一条cDNA链为模板,扩增得到目的基因OjRCA.用Sma Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切目的基因及表达载体pBI121,回收后利用T4DNA连接酶连接,获得植物表达载体pBI121-OjRCA.通过冻融法将所获得的植物表达裁体导入根癌农杆茵EHA105菌株中,为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将OjRCA基因导入植物提高相关抗性提供参考.     

CMO,BADH双基因植物表达载体的构建

以pC1303质粒和pC1391质粒为基础,利用载体pBIUC和pBIB构建了分别有Ubi启动子、35S启动子调控的带有控制甜菜碱合成的CMO和BADH的植物表达载体pC1303-Ubi-CMO-35S-BADH,为进一步开展提高植物抗逆性基因工程提供了基础.     

Development of the binary vector pTACAtg1 for stable gene expression in plant: Reduction of gene silencing in transgenic plants carrying the target gene with long flanking sequences

Genetic modification in plants helps us to understand molecular mechanisms underlying on plant fitness and to improve profitable crops. However, in transgenic plants, the value of gene expression often varies among plant populations of distinct lines and among generations of identical individuals. This variation is caused by several reasons, such as differences in the chromosome position, repeated sequences, and copy number of the inserted transgene. Developing a state-of-art technology to avoid the variation of gene expression levels including gene silencing has been awaited. Here, we developed a novel binary plasmid (pTACAtg1) that is based on a transformation-competent artificial chromosome (TAC) vector, harboring long genomic DNA fragments on both sides of the cloning sites. As a case study, we cloned the cauliflower mosaic virus 35S promoter:β-glucuronidase (35S:GUS) gene cassettes into the pTACAtg1, and introduced it with long flanking sequences on the pTACAtg1 into the plants. In isolated transgenic plants, the copy number was reduced and the GUS expressions were detected more stably than those in the control plants carrying the insert without flanking regions. In our result, the reduced copy number of a transgene suppressed variation and silencing of its gene expression. The pTACAtg1 vector will be suitable for the production of stable transformants and for expression analyses of a transgene.     

一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究

将表达载体pEC34中的一段寡核苷酸序列,其中包括翻译增强子序列、SD序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点,插入GST基因后,构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白2A(hBMP2A)和人骨形成蛋白3(hBMP3)C端肽段,将第一顺反子基因（GST基因）切小到原来的1／3时,则位于下游的第二顺反子基因编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达量增加一倍。     

鸡输卵管特异表达载体的优化及体内表达

为了实现鸡输卵管特异表达载体在相应组织特异高产表达, 并简化质粒DNA的制备过程, 本研究在已经构建的鸡输卵管特异表达载体pOV1基础上进行了优化改造, 为进一步进行重组药物蛋白的暂态表达及转基因鸡研究奠定基础。首先用限制性内切酶将克隆在pOV1载体的鸡卵清蛋白基因5￠-和3￠-调控区切出, 同时克隆到切除neo基因及CMV启动子的pcDNA3.0载体, 构建成另一输卵管特异表达载体pOV2; 将鸡卵清蛋白基因5￠-调控区单独克隆入同样载体, 获得第三个鸡输卵管特异表达载体pOV3。为了检验三个输卵管表达载体驱动外源基因在鸡体内输卵管细胞中表达的有效性和特异性, 将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3中5'-调控区的下游, 获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经聚乙烯亚胺包裹后, 经翅静脉注射产蛋鸡。用RT-PCR和酶活性检测法对LacZ基因在载体注射鸡体内的表达进行检测, 结果显示肝、脾、肾、心等组织中无LacZ基因的表达, 而输卵管膨大部不仅有LacZ基因的表达, 而且表达的重组酶能分泌到蛋清中, 雌激素注射对报告基因的表达具有促进作用, 其中pOV3LacZ的表达水平较高。这些试验结果表明, 鸡输卵管特异表达载体pOV3具有结构相对简单、表达水平较高、组织特异性较好等优点, 能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因(ov)的5′和3′调控区,将其克隆入pGEMT载体,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体5′调控区的下游,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡,RTPCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中,仅输卵管膨大部能检测出β半乳糖苷酶活性(1167mUml),注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用(1533mUml),重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中(1733mUml)。结果表明,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

AGPase基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

将大肠杆菌BL21的AGPase基因定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,从而构建植物表达载体,转化烟草获得了转基因植株。经GUS组织化学染色、PCR、Southern blot以及RT-PCR鉴定证实,该基因已导入烟草基因组中。淀粉含量测定结果显示,转基因植株比非转基因植株淀粉含量平均增加了13.1%,由此验证了该载体构建的成功与可用性,为下一阶段用该载体转化木薯主栽品种提高块根淀粉含量的研究奠定了基础。