甲肝病毒减毒株(H2)RNA的全长RT-PCR扩增

通过RT-PCR技术扩增了甲肝病毒减毒株(H₂)全长RNA,并对长片段RT-PCR扩增进行了方法学上的探讨.采用抗血清特异沉淀病毒;盐酸胍-酸性酚、氯仿一步法分离纯化病毒RNA,可得到高质量的RNA样品;以此RNA为模板,在无RNA酶的逆转录酶作用下,合成单链cDNA;继续以此cDNA为模板,利用32 mer寡核苷酸引物, 在Taq和Deep Vent DNA多聚酶的作用下进行PCR扩增,得到7.4 kb的扩增产物.     

单分子PCR产物错误率分析

碱基错配致使PCR扩增产物中存在突变序列.大量模板PCR扩增时突变序列所占的比例较低,对随后进行的PCR产物分析影响不大,但当对微量甚至单个模板DNA扩增时,情况则完全不同.对单分子PCR产物的错误率进行了理论分析,结果表明：根据实验目的和条件,选择忠实性不同的聚合酶是十分关键的.     

RecA蛋白介导的三链核酸结构形成及其序列提取

人工合成的单链DNA分子经PCR扩增形成双链DNA分子。将RecA蛋白与生物素标记的寡聚核酸探针序列在ATPγS存在的情况下共同哺育,使RecA蛋白包裹寡聚核酸探针,然后加入含同源序列的上述双链DNA分子经适当环境哺育形成了稳定的局部三链核酸结构。通过加入链亲和素包裹的磁珠吸附生物素化的探针,这样同源双链DNA分子与寡聚核酸探针形成的局部三链核酸结构也被吸附在磁珠上。使用磁分离装置提取这一结构,逐步降低盐离子浓度以洗脱双链DNA分子。将洗脱液中残留的蛋白质去除,经PCR扩增可获得目的DNA序列。同时使用同源探针和非同源探针在其它序列中提取目的DNA序列,结果显示目的DNA序列只被同源探针提取。实验结果显示了这一三链核酸结构形成的序列特异性,并且其稳定性随盐离子浓度降低而下降。提示在这一结构中同源的寡聚核酸单链与双链DNA分子形成了氢键结合,同时提示使用文中描述的方法可以提取特异的序列,用以克隆相应的基因。     

用两步PCR法克隆全长cDNA

采用两步 PCR法成功地克隆了一个全长的 c DNA.首先 ,用差式分析法克隆得到差别表达的 c DNA片段 ,再分别用这些片段内部的特异序列及 c DNA两端不同接头的序列为引物进行第一步 PCR扩增 ,得到差别 c DNA片段的上游和下游序列 .然后 ,根据第一步 PCR扩增得到的上游和下游序列设计基因特异的引物进行第二步 PCR,从而得到全长的 c DNA.     

DNA足纹步移作图法

一种以PCR介导的、可对任意长度靶DNA片段上的核蛋白结合位点进行DNA足纹作图分析的新方法.原理是：采用被随机降解靶DNA分子作为模板,用标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物进行单链扩增.首先,利用某种化学试剂或酶如DNaseⅠ对已与蛋白质结合或未结合的双链靶DNA进行随机降解,在一定条件下使每一个DNA分子恰好只有一个位点被切割.然后,这些被随机降解DNA分子即可作为模板,用同位素标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物（正向或反向）进行单链扩增.最后,扩增的单链产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影形成DNA片段梯队,而被蛋白质保护的位点则在DNA片段梯队中形成位置缺口,从而确定DNA与蛋白质相结合的精确位点.该方法被应用对人干细胞因子基因5′旁侧－1190～－273区域的DNA足纹部分作图.     

改进的反向PCR技术克隆转移基因的旁侧序列

对传统的反向PCR技术作了一些改进：用巢式PCR扩增含量极少的靶序列;PCR反应体系中加入5%的甲酰胺以减少非特异性扩增.结果表明,改进的反向PCR体系是克隆人基因组已知片段旁侧序列的高度灵敏、高度特异的方法.     

过量DMSO显著降低低模板浓度PCR扩增的特异性

DMSO通常经验性地用于提高PCR扩增的效率,但是过量的DMSO可以显降低特异序列的扩增效率,尤其是导致非特异性扩增的现象却被忽视。在6％的DMSO存在时,开始出现非特异条带,同时特异扩增产物减少。本首次报道DMSO对PCR产物特异性的影响并确定了克服上述现象产生的途径,即通过增加模板－引物的比例消除非特异条带。而通常提高复性温度只能部分减少非特异产物,不能避免非特异扩增。本结果有助于提高常规PCR,尤其是分子遗传学分析中经常使用的随机扩增多态性DNA（random amplifeid polymorphic DNA,RAPD）检测的准确度。     

小花棘豆(Oxytripis glabra DC)毒素基因的cDNA克隆及序列测定

在完成小花棘豆毒素 95 %氨基酸序列的基础上 ,根椐已知的氨基酸序列 ,设计合成了特异简并引物 .以小花棘豆总RNA为模板 ,逆转录合成cDNA第一链 ,用置换法合成双链cDNA .用特异引物对此双链cDNA进行PCR扩增 ,将扩增后的目的基因与用SmaⅠ酶切的质粒pUC 18连接 ,转化大肠杆菌JM10 7.筛选阳性克隆进行序列分析 ,获得了OXY基因的全部序列 .经测序后测得基因序列与原氨基酸序列对照完全一致 .GenBnak数据检索说明 ,OXY基因编码序列确定是一个从未报道的序列 .此研究结果对该毒素的应用研究奠定了基础 .     

2例PCR扩增失败的分析与探讨

根据GenBank报道的序列设计引物,PCR扩增克隆玉米乙醇脱氢酶1(Adh)核基质结合区序列及大鼠脑啡肽基因。扩增的序列电泳分析条带与预期的片段大小基本一致,但测序分析均为非目的片段,为非特异PCR产物,一例为非靶序列间的重复序列配对造成,一例为一侧引物单独引起,重新设计引物,采用巢式PCR获得了目的基因片段。     

四核苷酸重复序列单链扩增特性及机理探究

简单重复序列广泛存在于多种生物基因组中,其生物学意义越来越受到人们的重视.许多简单重复序列易于扩增变长,某些重复序列的异常延伸是造成一些遗传疾病的直接原因.本研究以20 nt的60种四重复和6种二重复序列单链为模板,系统研究了它们在嗜热DNA聚合酶作用下等温扩增的特点.电泳结果显示,多数单链模板能扩增变长,即使链内没有互补碱基的序列也可被扩增,如(AGGA)5.定量分析结果显示:回文序列扩增最快;二重复序列比相同碱基组成的四重复序列有更宽的适于扩增的温度范围;G和C含量多的DNA较G和C含量少的序列更易扩增,而且G和C含量越多越适于在较高的温度下扩增;重复单位含两相同嘧啶的链多数比其互补链更易扩增;产物浓度与时间基本呈线性关系.限制性酶切产物结果显示,扩增产物与模板具有相同的重复单位,是重复序列的简单延伸.最后,根据实验结果和相关文献,提出了包括链内滑动扩增和发卡DNA介导扩增两阶段的重复序列单链扩增模型,以对重复序列非特异扩增和相关疾病发生机制的研究提供参考.     

巨型引物PCR法对抗CD3改型单链抗体

亲和力是影响改型单链抗体应用于临床的重要因素之一.利用巨型引物PCR定点诱变方法,设计并化学合成出两组含多个突变位点的简并引物,在第一轮PCR中使用简并引物分别扩增出含突变碱基的两条特异性的DNA片段,即巨型引物,将其经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,作为3′和5′的两端引物应用于第二轮PCR反应中.通过改变标准PCR反应条件,调整引物与模板的浓度,扩增出特异性较强的目的DNA条带.PCR产物经回收后,进行DNA测序.测序结果表明利用该方法扩增得到特异的抗CD3改型单链抗体的突变体库.     

甜菜碱增强长片段PCR的扩增

聚合酶链式反应 (PCR)作为一项非常成熟的技术可以用于基因组序列的扩增。普通的PCR技术只适合于短片段DNA的扩增 ,一般在 6kb以下。对于 6kb至十几kb甚至几十kb以上的DNA片段的扩增就非常困难。通过添加不同化学物质 ,发现甜菜碱对长片段PCR的扩增有非常有效的增强作用。通过对玉米总DNA以及质粒DNA的扩增 ,发现 1mol L到 25mol L甜菜碱对改进PCR扩增效果明显。通过添加甜菜碱 ,可以从玉米基因组中扩增出 9kb以上的单拷贝片段 ,从质粒中扩增出 16kb以上片段。经过试验 ,发现不同GC含量的引物需要使用不同浓度的甜菜碱。甜菜碱可以减少甚至消除长片段PCR中的非特异性扩增。同时 ,我们发现其它的添加物 ,如DMSO ,甘油 ,甲酰胺对长片段PCR的作用不明显     

PCR条件及程序改变对抗体库多样性的影响

用家族特异性免疫球蛋白可变区基因引物两两组合分别对轻、重链进行RT-PCR扩增. 在不同退火温度下得到了全部轻链及大部分重链（13/16）可变区基因. 当先用免疫球蛋白信号肽序列5′-端引物与未扩出基因3′-端引物组合进行一次PCR,再以该产物为模板进行二次PCR,则获得了未扩出三条重链的PCR产物. 这表明通过PCR反应条件的改变及程序调整,可增加所获得可变区基因的种类及数量,从而增加抗体库的多样性.     

优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变

利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点,国内外文献未见其方法学的系统报道.以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR,针对影响重叠PCR扩增的拼接类型,引物设计,反应条件等进行优化.结果表明两段重叠连接比三段更容易实现,且扩增效果好;引物的互补序列长度一般应大于15 bp,且在18～24 bp 时扩增效果最好;退火温度在52～60℃,Mg2+浓度在1.5～2.5 mM时对拼接的效果影响较小;直接或间接使用拼接模板均可以实现重叠PCR的扩增.利用优化策略,首次构建了抗除虫菊酯的scFv基因文库并引入抗XAC糖蛋白scFv基因的点突变,为除虫菊酯抗体文库构建和抗XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础.     

利用Taq DNA聚合酶直接从双链RNA模板中扩增靶序列

利用Taq DNA聚合酶既具有DNA聚合酶活性义具有反转录酶活性的特点,探索了在Taq DNA聚合酶单独作用下以双链RNA为模板进行PCR反应的条件。结果表明靶序列长度为277 bp、369 bp、987 bp时,均可直接进行PCR扩增;短片段序列扩增的退火温度在47．0℃、47．9℃、50．2℃、52．6℃、54．9℃、56．7℃条件下,均可有效扩增,而长片段序列扩增的退火温度在50．2℃、52．6℃、54．9℃、56．7℃条件下,也可扩增出相应的靶序列。这一结果提示利用Taq DNA聚合酶可以dsRNA为模板直接扩增目的片段,尤其是短片段的扩增。     

甜菜碱增强长片段PCR的扩增

聚合酶链式反应(PCR)作为一项非常成熟的技术可以用于基因组序列的扩增。普通的PCR技术只适合于短片段DNA的扩增,一般在6kb以下。对于6kb至十几kb甚至几十kb以上的DNA片段的扩增就非常困难。通过添加不同化学物质,发现甜菜碱对长片段PCR的扩增有非常有效的增强作用。通过对玉米总DNA以及质粒DNA的扩增,发现1mol／L到2．5mol／L甜菜碱对改进PCR扩增效果明显。通过添加甜菜碱,可以从玉米基因组中扩增出9kb以上的单拷贝片段,从质粒中扩增出16kb以上片段。经过试验,发现不同GC含量的引物需要使用不同浓度的甜菜碱。甜菜碱可以减少甚至消除长片段PCR中的非特异性扩增。同时,我们发现其它的添加物,如DMSO,甘油,甲酰胺对长片段PCR的作用不明显。     

过量DMSO显著降低低模板浓度PCR扩增的特异性

DMSO通常经验性地用于提高PCR扩增的效率,但是过量的DMSO可以显著降低特异序列的扩增效率,尤其是导致非特异性扩增的现象却被忽视.在6%的DMSO存在时,开始出现非特异条带,同时特异扩增产物减少.本文首次报道DMSO对PCR产物特异性的影响并确定了克服上述现象产生的途径,即通过增加模板-引物的比例消除非特异条带.而通常提高复性温度只能部分减少非特异产物,不能避免非特异扩增.本文结果有助于提高常规PCR,尤其是分子遗传学分析中经常使用的随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)检测的准确度。 Abstract:DMSO is the most often empirically used to increase efficiency of PCR.However,it is ignored that DMSO can also decrease the amplification of specific sequences and result in non- specific amphfications.Non-specific bands are detected at 6% DMSO,as specific amplification declines.This is the first report about the effects of DMSO on the specificity of PCR and establishment of the method for avoiding non-specific products,which can be overcome by increasing template-primer ratio rather than annealing temperature.Our data will be of much help for random amphfied polymorphic DNA (RAPD) assays for molecular genetic analyses.     

西部马脑炎病毒基因组序列的半套式RT-PCR检测

为进一步提高RT－PCR检测西部马脑炎病毒（WEE）病毒基因组方法的敏感性,采用半套式PCR扩增病毒基因组特异序列,首先采用逆转录法将病毒基因组RNA逆转录为cDNA,然后以此cDNA为模板,进行扩增。对扩增后电泳检查无可见DNA条带的产物进行半套式PCR;与此同时对扩增的循环数、Mg^ 浓度和退火温度等条件进行了优化,以进一步提高扩增的特异性。结果第一轮PCR未扩出特异笥片段的WEE病毒稀释度,其半套式扩增出特定大小的DNA产物;同时优化的条件提高了扩增产物的特异性。扩增产物约为190bp的单一DNA片段,其大小与预期的相一致,结果表明采用半套式RT－PCR方法检测WEE病毒的基因组序列的敏感性可提高100倍以上。     

利用交错延伸剪接PCR技术扩增油菜花粉育性基因MS2Bnap全长cDNA序列

交错延伸剪接PCR是一种用于分子进化研究的DNA改组技术。本实验利用其原理,将已获得的油菜花粉育性MS2Bnap有部分序列重叠的三段PCR产物作为模板进行扩增,获得了花粉育性基因MS2Bnap的全长cDNA序列。