DNA重组技术(Ⅰ) 小量快速提取质粒DNA方法

质粒DNA的提取是最基础的DNA重组技术。国内外已经发展了许多方法用于批量提取质粒DNA。这些方法都可以获得满意的效果。这里介绍两种小量快速提取质粒DNA的方法,可用于重组子筛选及酶切分析。 (一)碱裂解法 1.将过夜培养的菌液1.5ml转移到小离心管内,15.000r/min离心30sec,弃去上清,将离心管倒置尽量除去培养液。 2.将沉淀的菌体再悬于100ml冰冷的溶液A中(50mM葡萄糖,25mM Tris pH8.0,10mM EDTA),不必要加入溶菌酶。 3.向A液中加入新配制的溶液B200μl(0.2N NaOH,1％SDS),迅速倒置几次,混合两溶液,放在冰浴上3—5分钟。 4.再加入150μl溶液C(5M醋酸钠60ml,冰醋酸11.5ml,蒸馏水28.5ml)混均后冰浴3～5分钟。     

粟长蠕孢菌的原生质体转化

本文报道了利用具有潮霉素抗性标记的质粒(pAN7-1)对粟长蠕孢菌原生质体进行转化的结果。经pAN7-1质粒DNA转化处理的粟长蠕孢菌原生质体在含潮霉素(200μg/ml)的选择性培养基上出现两类转化子。一类是正常转化子,其转化率为2个转化子/μg DNA;另一类是流产转化子,其产生频率为500—600个转化子/μg DNA。DNA杂交分析结果表明,在正常转化子中质粒DNA以首尾相接、重复排列的形式整合入受体菌染色体DNA。初筛获得的转化子多数以异核状态存在,经单孢分离纯化后可通过有丝分裂稳定传代。     

部分酶解酵母高效电击转化研究

以酵母质粒YCp50为外源DNA,电击转化部分酶解酵母宿主菌AB1380,转化效率稳定在10~6转化子/μg质粒DNA左右,比不酶解酵母或酵母原生质球作受体的电击转化效率高一个数量级以上,也比PEG介导的酵母原生质球转化高3～5倍,而且适合于大片段DNA如水稻YAC分子的转化。达最佳转化时的有关技术参数为:新接菌种通气培养至细胞密度1×10~8～1.5×10~8个/ml;转化时细胞密度控制在1×10~9～1.5×10~9个/ml;每毫升酶解缓冲液加15u溶菌酶(lyticase),30℃下处理酵母5min进行部分酶解;电击时,电场设置在6.25kV/cm、电容25μF,电击后直接铺板。     

基因诱变、重组、克隆

923552甲醇利用型嗜甲基菌属耐热菌株的高效电激转化[英]/Haider,M.Z.…/Acta Biotechn01.一1991,21(4)一295~301[译自DBA,1902,11 (7),92一03606〕 采用pUC19、pBR322、pCMi、pUC/CAT以及由pSAS片段与pUC19的重组质粒(P USM4、pUSFio、pUSMZo)作为载体。分别用感受态、原生质体和电激三种转化法转化万eth好。夕瓜-105属菌株KISRI一5112(NCIB 12138)、KISRI一512(NCIB 12137和KISRI一6.1(NCIBiZi36)。在25产F、3 kV、1 .5一5 kV/cm电激条件下成功地转化了质粒(P UCM20的转化率达180万转化子/拼9 DNA),并稳定…     

多粘芽孢杆菌质粒的研究——Ⅱ.多粘芽孢杆菌原生质体形成、再生与转化

多粘芽孢杆菌P250-2完整菌体不能作为质粒DNA的转化受体,但其质粒消除菌株P_0250-5制成的原生质体,可接受多粘芽孢杆菌的pBD2502及枯草杆菌的pUB110质粒DNA转化。在高渗蔗糖再生培养基上,原生质体再生率为20％左右,形成率在95％以上。在含新霉素(10μg/ml)、青霉素(25μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)的高渗蔗糖再生培养基上分别获得了转化子。多粘芽孢杆菌的转化频率为3.29×10~(-3),枯草杆菌为4.4×10~(-4)。转化子的形态表现、生化特性和抗菌谱与给体菌株一致,表明多粘芽孢杆菌株间及多粘芽孢杆菌和枯草杆菌种间的质粒可以进行转化。     

大豆脲酶基因片段的无性繁殖

纯化的大豆细胞总DNA及质粒pBR322DNA分别经限制性内切酶HindⅢ切割,并用T_4DNA连接酶连接,进行重组。将重组后的DNA转化Escherichia coli C600。用四环素、环丝氨酸富集法浓缩和筛选对氨基苄青霉素具有抗性而对四环素敏感的重组转化子(Ap~rTc(?))。以酚红的显色反应及以脲素为唯一氮源从Ap~rTc~(?)转化子中筛选具有脲酶活性的无性繁殖系,获得一株转化子E.coli C600(pSH120),并从中分离了重组质粒pSH 120 DNA,经凝胶电泳法测定其分子量为12.9×10~6道尔顿。用重组质粒pSH 120 DNA分别转化E.coil C600和E.coliHB101,均能再产生具有脲酶活性的Ap~rTc(?)重组转化子。     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究

从黑曲霉N25(A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1.4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体(命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母。经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP-NP-1(23869.4u/ml)、PP-NP-2(20533.0u/ml)、PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活(513.4u/ml)的46.46倍、39.99倍和69.46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

基因诱变、重组、克隆

930043利用重组DNA技术改良真菌产物的合成[会,英]/Finkelstein,D.B.…/Ann.N.Y.AC—ad.Sci.一1991,646.一202～206E译闩DBA,1992,11(13),92·07231] 对丝状真菌的转化最初是通过同源DNA进行(如用克隆的qa2基因对粗糙链孢霉进行缺陷补偿)。在几乎一半转化子中,DNA通过非同源重组整合到基因组中。发展了几种载体,用于转化野生型丝状真菌(如转化原垓的杀真菌基因,用的是真菌启动子)。在某些实例中,同源基因可以被用作选择标记。针对一些有突变(并容易被补偿)的菌类,发展了相应的选择体系。重组真菌若要进入实用阶段,在大容量发酵罐中…     

动物细胞培养及单克隆抗体

930909磁性处疆培鼍I|基促进杂交囊生长[英]/Pedraza,A.…/Biotechn01.Tech.一1992,6(4).一329'334~译自DBA,1992,11(17),92-09883] 小鼠杂交瘤细胞系CB-IFNA2.4产生抗重组干扰素-a-2b的IgGl单克隆抗俸(MAb)。将杂交窟培养在磁化RPMI-1640培养基中。培养基补加10％新生牛血清、2raM谷氨酰胺、0.4graM丙酮酸钠和40#g/ml庆大霉素。直径0.3cm的Tygon灭嚣管(总长75cm)外包永久性磁铁,使培养基以0.1和0.0002ml/秒的流量循环通过该管(1--,5次)使培养基磁化。磁场强度为0.02、0.05、0.09和O.1T。细胞子37℃下,处于静止生长期培养(10万…     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赫酵母中高效表达的研究

从黑曲霉N25（A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1．4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体（命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母,经G418抗性筛选,酶活性测定,Southern 印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP－NP－1（23869．4u/ml),PP-NP-2(20533.0u/ml),PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活（513.4u/ml)的46．46倍,39．99倍和69．46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

解淀粉芽孢杆菌赖氨酸-3基因在枯草芽孢杆菌中的克隆

限制性核酸内切酶EcoRI酶切解淀粉芽孢杆菌ASl.1099染色体DNA和质粒pUB lloDNA,T4 DNA连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BRl51(trpC2痢“B5 ly.f3 Neo')感受态细胞。用选择性培养基两次筛选,得到Neo‘和与BR 151 lys3营养缺陷突变互补的菌落。用快速测定质粒的方法检查,其中有13株转化子带有大小相同的重组质粒。分离其中l株转化子BRl51-29的重组质粒pB--L29 DNA,再次转化BRl51感受态细胞和原生质体。测定第二次得到的转化子性状,均与转化子B1~151-29相同。琼脂糖曩胶电泳检查这些转化子的质粒,其分子大小也与t组质粒pB--L29相同。以上试验证明,重组质粒pB--L29是由pUBll0和解淀粉芽孢杆蕾的咖3基因片段构成的。根据琼脂糖凝胶电泳测定pB--L29的分子量约为5.0kb,推断出l~,J3基因片段约为O.5kb。     

组织与原生质体培养

950616从电激原生质体再生转基因大豆植株[英]/Dhir,S.K.…/P1ant Physi01.一1992,99(1).一81～88E译自DBA,1992,11(14),92—08040] 质粒DNA携带CaMV35S启动子调控的新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因,该基阈与冠瘿碱生物合成的非选择标记相连。从上述质粒电激处理后的原生质体衍生愈伤,并再生出转基因大豆植株。从电激后培养的第15天开始,用卡那霉素(50pg/m1)选择。6周内,从1百万个电激原生质体中选出370～460个抗性集落,绝对转化频率为O.00037～O.00046。其中80％以上的集落具有NPT’Ⅱ活性,这些集落的90％产生冠瘿碱。连接的标记基…     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究*

从黑曲霉N25(A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1.4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体(命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母。经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP-NP-1(23869.4u/ml)、PP-NP-2(20533.0u/ml)、PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活(513.4u/ml)的46.46倍、39.99倍和69.46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

芽孢杆菌原生质体作为质粒DNA转化的受体

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B3F 7658,短小芽孢杆菌(B. pumilus) AS 1.940,巨大芽孢杆菌(B．Megaterium) AS 1.941,和多粘芽孢杆菌(B. polymyxa) AS 1.878等菌株,既不能作为染色体DNA的转化受体,也不能作为质粒DNA的转化受体。用不同量的溶菌酶处理这些菌株形成原生质体,然后加pUB110质粒DNA,经聚乙二醇6000(PEG)诱导,在含新霉素(400μg／ml)的DM-3再生培养基上恢复细胞壁,培养48小时后,转化子数为1.0 x 103一4.6×105／μg DNA。若同时用PEG和Ca2+ 离子诱导,转化子数可提高2—3倍。质粒pUBll0用EcoRI酶切后,转化子数大大下降(2.0×102转化子／μg DNA)。Eco RI酶切后,用T4连接酶连成环状,转化子数有所增加(1．7×103转化子／μg DNA)。     

HBV PreS1-EGFP融合表达质粒高效转化毕赤氏酵母的研究

目的:实现HBV PreS1-EGFP融合表达质粒高效转化毕赤氏酵母.方法:分别将乙肝病毒前S1蛋白和绿色荧光蛋白克隆到表达载体pPIC9K,获得重组质粒pPIC9K-EGFP-preS1,Sac1位点酶切线性化,采用醋酸锂(LiAc)和二硫苏糖醇(DDT)对巴斯德毕赤氏酵母Pichia Pastoris GS115预处理,在电压1.5 kv、电容25 F条件下进行电击转化.电击后立即迅速稀释在冰预冷的1 M的山梨醇中,混匀后取100 l的菌液均匀涂布YNBG平板,利用HIS4标记筛选转化子.结果:发现改进后的转化方法pPIC9K-EGFP-preS1的转化率提高到164×10 4个转化子/1μgpPIC9K-EGFP-preS1 DNA,是传统方法的6.6倍.结论:采用改进后的方法能有效的提高质粒pPIC9K-EGFP-preS1的转化率,为筛选高表达HBV PreS-EGFP融合蛋白的转化子打下基础.     

灰葡萄孢菌AUR1基因真核表达载体的构建、表达及酶活性分析

为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶(BcAUR1基因)的表达及酶活性,采用RT-PCR方法,利用含有FLAG标签以及BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因.将BcA UR1基因与穿梭质粒pYES2重组,得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株△yor1中,Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺(IPC)合成酶表达,HPLC检测IPC合成酶活力.结果显示pYE S2-BcA UR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株△yorl中获得表达,pYES2-BcA UR1转化子IPC合成酶活性显著增高,比空载转化子约提高1倍.低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长,但pYES2-BcA UR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制.     

地衣芽孢杆菌感受态细胞的形成及高效电转化

芽孢杆菌在营养缺乏的饥饿状态下,细胞易产生感受态因子,处于生长芽孢时期的芽孢杆菌更容易产生感受态。基于此原则利用芽孢杆菌极限营养培养基通过体外处理诱导使地衣芽孢杆菌产生感受态性能,同时调整参数,建立了感受态细胞对质粒pAPR的高效电转化方法。当质粒DNA浓度为1．5μg/ml、转化时电压为1750V的时候,可以得到261个转化子,经鉴定均为阳性克隆子。而常规电转化的最高仅为20个转化子。为以芽孢杆菌为宿主进行高效电转化提供了模型,也为建立适合工业应用的分泌型表达载体的构建打下了一定基础。     

用凝胶电泳纯化具有生物学活性的质粒DNA

采用一般柱电泳装置,在琼脂糖凝胶上将质粒ColEl、pBR322、pSC101、pCRI的DNA与染色体DNA及小分子核酸杂质分开,切出含有质粒的凝胶薄片,电洗脱回收质粒DNA,产物可被限制酶Eco RI酶解;将pBR 322、PSC 101、pCRI DNA转化大肠杆菌C_(600),每微克DNA可产生10~4个转化子;从pSC 101、pCRI转化子细胞中再抽提出相应质粒,它们同样具有亲本质粒的遗传特性和分子特性。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段在枯草芽孢杆菌中的克隆

EcoRI酶解的AsGV-XJ DNA和质粒pUB 110 DNA,经T4 DNA连接酶连接后,转化枯草芽孢杆菌BR 151感受态细胞,涂布在加有新霉素(5,ug／ml)的完全培养基上。用琼脂糖凝胶电泳快速法检测抗新霉素转化子中的重组质粒。在388个转化子中得到12个较PuB110 DNA分子量大的重组质粒。所有重组质粒均可与”PdcTP标记的Fco RI酶解AsGV—XJDNA片段的探针进行分子杂交。通过琼脂糖凝胶电泳对重组质粒中插入AsGV一XJ DNA 片段进行了测定。     

红色荧光蛋白在丝状真菌里氏木霉中的表达

目的:建立红色荧光蛋白在里氏木霉中的表达方法,为深入研究里氏木霉中纤维素酶的合成机理打下基础。方法:采用PCR方法分离了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ(CBHⅠ)的启动子(Pcbh1)和终止序列(Tcbh1),将这两个片段与红色荧光蛋白(DsRed)的基因连接,得到Pcbh1-DsRed-Tcbh1表达盒。用此表达盒和质粒pAN7-1对里氏木霉QM9414的原生质体进行共转化,并用含100μg/ml潮霉素B的选择性平板进行筛选。结果:经筛选得到20个抗性转化子,在乳糖的诱导下有5个转化子可以表达红色荧光蛋白。对插入片段进行了扩增和序列测定,结果表明DsRed通过同源重组整合到了转化子的基因组DNA上,并处于cbh1启动子的下游。结论:通过cbh1启动子可以实现红色荧光蛋白在里氏木霉细胞内的稳定表达。