人凝血因子Ⅷ工艺研究进展

人凝血因子Ⅷ(Human coagulation factorⅧ,FⅧ)是人血浆中重要的蛋白质,是人体内源性凝血途径的主要成分,血液中FⅧ过低会导致不同程度的凝血功能障碍。目前国内FⅧ大多以血浆冷沉淀为起始原料,采用离子交换层析纯化获得"#$。在此工艺中,血浆的采集、血浆融化、冷沉淀离心、冷沉淀的溶解、层析前样品的预纯化、离子交换层析条件、病毒灭活、冻干工艺均对FⅧ的质量影响较大,因此主要从这几方面进行了综述。     

凝血因子Ⅷ与中国人血友病甲研究进展

血友病甲为最常见的遗传性出血性疾病,是由于血浆凝血因子Ⅷ（FⅧ）缺陷所致．FⅧ基因位于Ⅹ染色体,所以患者绝大多数为男性,女性杂合子为携带者,而女性患者极少见。重型患者自幼即有反复自发性出血,不经治疗者往往造成关节畸形和致残．严重者可因颅内出血死亡。目前仍以替代疗法为主[1]。随着FⅧ基因的克隆和基因突变检测技术的发展,血友病甲的直接基因诊断和遗传咨询等方面已经取得突破性进展．基因治疗的实验研究也正开展得如火如茶．我国近年不仅对血友病甲进行了大规模的流行病学调查,也从分子水平进行了多方面的研究。1F见Ⅷ…     

凝血因子Ⅷ分子生物学研究进展

凝血因子 在机体内源性及外源性凝血途径中起着重要作用。 1984年其基因克隆成功 ,并在哺乳动物细胞中得到表达 ,使其基因及蛋白质分子结构的研究取得很大成就 ,为其临床应用和血友病甲的治疗奠定了基础     

凝血因子Ⅷ

人凝血因子Ⅷ(抗血友病因子)是凝血内部级联途径(intrinsic clottingcascade)中起重要作用的血浆糖蛋白。A型血友病或称古典血友病是由于不正常的凝血因子Ⅷ引起的,10万名男性中发病率约为10—20人。近十年来,人们关于凝血因子Ⅷ,特别是它的基因和蛋白分子结构方面的知识日益增加。这篇综述总结了人凝血因子Ⅷ的结构和基因的分子克隆以及血友病的遗传诊断及治疗方面的新进展。     

人凝血因子Ⅷ制剂冻干工艺

优选了人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制剂的冻干工艺。通过电阻法测定共晶点,再采用正交试验法,对预冻温度、主要干燥温度、主干燥时间、解析温度与真空压力等进行研究以优选冻干工艺,得到最佳的冻干工艺:-40℃预冻1.5 h;主要干燥温度从-40℃升温至-33℃,再从-33℃升温至0℃,总耗时36 h,真空压力为30 Pa;解析温度维持在35℃,真空压力为5 Pa,于终点测试压力无变化时结束。由于该工艺冻干出的人凝血因子Ⅷ制剂符合《中国药典》3部该项下的质量要求,经验证该冻干工艺能够应用于人凝血因子Ⅷ制剂的大规模生产。     

克隆凝血因子Ⅷ

生物技术业最富雄心且令人振奋的目标之一已经达到。在本期发表的四篇论文中,Genentech公司(在伦敦皇家自由医院Tuddenham等帮助下)和遗传研究所公司(在罗彻斯特Mayo诊所帮助下)报告了指导合成人凝血因子Ⅷ的:C的DNA的克隆,以及克隆DNA在哺乳动物细胞系中表达以生产这种凝血因子的情况。     

长效重组人凝血因子Ⅷ研究现状及进展

重组凝血因子Ⅷ(rFⅧ)替代疗法是目前临床上治疗A型血友病最为有效的方法。过去十几年的临床试验已经验证了rFⅧ替代疗法的安全性和有效性,但由于FⅧ的半衰期较短,患者需要隔天或者每周3次进行静脉注射治疗。长期频繁静脉注射治疗不仅给患者带来肉体上的痛苦,还容易产生FⅧ抗体,严重影响治疗效果。以下就目前长效型重组凝血因子Ⅷ的研究进展及存在的主要问题进行了综述。     

人凝血因子Ⅷ基因克隆可在哺乳动物细胞株中表达

最近,美国的Genentech与Genetics Institute的二组科学家同时成功地克隆了凝血因子Ⅷ∶C的DNA,并使其在哺乳类细胞株中表达产生有活性的因子Ⅷ∶C。他们根据已纯化的来源于猪或人因子Ⅷ∶C的一小片段氨基酸序列,合成出寡核苷酸探针,用此探针从基因库中找出了因子Ⅷ的基因,并已弄清楚这段基因总长为186000bp,共有长度为69～3106bp不等的26个外显子,整个基因约占X染色体的0.1%。他们分别利用人的T细胞杂交瘤株或人肝获得了cDNA克隆,并根据cDNA的序列分析推断出成熟蛋白的2332个氨基酸序列。结果显示,多肽链中有与凝血因子V结构同源的区域以及与血浆铜兰蛋白结     

人凝血因子Ⅷ效价凝固检测法的验证及应用

目的 对凝固法检测人凝血因子Ⅷ(FⅧ)效价进行验证,并考察正常质控血浆(CPN)和人凝血因子Ⅷ国家标准品(CRM)贮存的稳定性.方法 实验采用贝克曼ACL7000全自动凝血仪及配套试剂检测人FⅧ效价,依据2003年版《药品生产验证指南》,选择准确度、线性、范围、重复性、中间精密度、耐用性6个参数进行验证;CRM和CPN复溶后分装冻存于-80℃保存,不同时间检测其复融1次后的效价.结果 实验结果表明,该法检测CRM 5个不同效价的回收率为85％ ～93％,重复性的CV均＜10％,不同试验人员检测相同样品和不同时间检测相同样品的CV均＜10％,人凝血因子ⅧCRM在0.30 ～ 1.21 IU/mL范围时r2=0.996(＞0.980);肝素钠浓度≤0.25 U/mL时无干扰.CRM复溶后分装并冻存1次的效价损失至少20％,随着冻存时间延长损失更多;冻融1次的CPN 2个月内效价基本没有损失.结论 用全自动凝血仪凝固法检测人凝血因子Ⅷ方法有效;CRM复溶后冻存效价有所下降,需重新标定后再用,冻融1次的CPN效价至少2个月内保持稳定.     

植物遗传工程研究进展

最近几年,DNA重组及其遗传操作技术的迅速发展,以及植物组织培养技术的日臻完善,为植物遗传工程的发展奠定了坚实的基础。将特定的外源基因引入到受体植物细胞,并使其定向而稳定的遗传,这是常规遗传育种方法所不能比拟的。植物遗传工程在发展农业、医学、环境等方面有着巨大的实际应用潜力,日益受到人们的重视。本文介绍一些转化体系,常用基因的特性及外源基因有效地表达及其调控的问题。     

第三批人凝血因子Ⅷ浓制剂国家标准品的协作标定

为更替第二批人凝血因子VⅢ浓制剂国家标准品,以WHO97/616批重组人凝血因子Ⅷ浓制剂国际标准品为对照,采用一期法协作标定第三批人凝血因子Ⅷ浓制剂二个候选国家标准品X和Y.并将标准品分别置4℃、22℃、37℃保存4.5个月,用加速破坏试验进行稳定性考查.结果表明,X(20010606批)候选标准品效价为3.8IU/支;Y(20010607批)候选标准品效价为7 3 IU/支.X批候选标准品比Y候选标准品稳定性好.其它项目均达到国家标准品要求.故已完成建立第三批人凝血因子Ⅷ浓制剂国家标准品.     

日本也开始重组凝血因子Ⅷ临床试验

西德拜尔公司小组宣布,继在欧美之后,在日本也开始了基因重组生产的凝血因子ⅥⅢ制剂的临床试验.预定从9月开始对少数血友病患者进行长时期的投予试验. 这种凝血因子ⅥⅢ是拜尔公司的美国子公司——Cutter Biological/Miles公司(加利福尼亚州伯克利)与Genentech公司(加利福尼亚州南圣弗朗西斯科)共同开发的.拜尔公司正在世界各国进行疗致试验,汇总出这些数据后即提出批准申请.     

凝血因子Ⅷ研究和应用的现状与前景

基因重组型凝血因子Ⅷ（rFⅧ)代替血浆来源的FⅧ（dFⅧ)治疗血友病甲是血友病治疗史上的一次革命,但仍存在难以令人完全满意的地方,而目前研制的二代rFⅧ即B区缺失型FⅧ具有的优点弥补了野生型rFⅧ的不足,必将促使患的选择由pdFⅧ彻底转向rFⅧ。     

重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建含有B区缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子Ⅷ(B domain-deleted human FⅧ,BDDhFⅧ)的真核表达质粒,转染HepG2细胞使其稳定表达人凝血因子Ⅷ。方法:将BDDhFVIII基因片段插入pcDNA4/v5-his空载体中构建重组真核表达质粒,测序正确后电转入HepG2细胞,经Ni-NTA纯化,利用Western blot检测凝血因子Ⅷ在HepG2细胞中的表达,持续培养获得稳定表达BDDhFⅧ蛋白的细胞株。结果:经限制性酶切和测序鉴定均证实重组真核表达质粒pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ成功构建,在转染HepG2细胞后,Western blot检测证实人凝血因子Ⅷ可以在HepG2细胞中正确表达。结论:成功构建了人凝血因子Ⅷ的稳定细胞株,并能在HepG2细胞表达目的蛋白。     

凝血因子Ⅷ和Ⅸ浓缩物病毒安全性的临床评价

<正>尽管在挑选献血者和血液筛选方法上已有进步,但传染性病毒仍能由单个献血者的血制品和大量混合的血浆衍生物传播,实际上,用凝血因子浓缩物治疗血友病病人,血生传染是一个公认的替代治疗的合并症。由于认识了这种危险,特别是AIDS传播的出现,在最近15年里,血液制品生产者已改