一种提高尸胺杆菌L-赖氨酸脱羧酶活性的培养基

某些细菌能产生特异性很强的L-赖氨酸脱羧酶,将其用于L-赖氨酸脱羧以测定L-赖氨酸含量,是行之有效的方法之一。我们用Gale等、日野哲雄和Soda等先后报道过的三种培养基培养尸胺杆菌(Bacte-     

场效应晶体管型赖氨酸传感器的研究

用自行研制的SOS型氢离子敏场效应晶体管,结合聚乙烯醇膜和赖氨酸脱羧酶膜,研制成场效应晶体管型赖氨酸传感器,其线性响应范围为:0.02％—0.10％,响应灵敏度75±3 mV,响应时间约2 min.传感器寿命达60 d,在pH 6.2的磷酸盐缓冲液中(含10^-3mol/L磷酸吡哆醛),37℃时器件性能最优,同时还考察了硅烷化及膜厚对器件性能的影响.用该传感器初步检测强化赖氨酸饮料的含量,结果与经典的茚三酮显色法基本一致.     

产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶的异源表达及粗酶性质

赖氨酸脱羧酶,可以催化赖氨酸脱羧生成戊二胺。戊二胺是重要的平台化合物,可以合成新型聚酰胺材料、脂肪族异氰酸酯等新材料。本研究对来自于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶进行异源表达。以pUC18质粒为载体,将来源于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶基因ldc克隆到大肠杆菌,得到菌株LN18。在添加0.5 mmol/L IPTG的LB培养基中,对LN18进行摇瓶培养,发酵液酶活可达到35 U/g发酵液,从发酵液制备的赖氨酸脱羧酶粗酶蛋白的酶活可以达到30 000 U/g粗蛋白。产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧粗酶蛋白大小约80 kDa,粗酶的最适温度和pH值分别为55℃和5.5,与文献中报道的大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶Cad A在pH 8.0几乎没有酶活不同,产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶在pH 8.0的酶活达到最优pH下酶活的30%以上。金属离子对酶活有一定的影响,Mg~(2+)对酶活有促进作用,Fe~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)有一定的抑制作用。     

L-赖氨酸脱羧酶酶电极的研制

将赖氨酸脱羧酶直接固定于CO₂电极的硅橡胶气透膜上制成的赖氨酸脱羧酶酶电极,性能如下:(1)酶电极对赖氨酸的线性响应浓度范围为0.0025—0.1％;极差为50—55mV;CV值小于5％;(2)连续使用寿命超过30天;(3)高度专一;(4)用于测定发酵过程赖氨酸浓度变化,结果与瓦氏呼吸仪的数据平行,相关性良好。     

赖氨酸脱羧酶分子改造及固定化合成1,5-戊二胺研究进展

1,5-戊二胺又名尸胺,是一种重要的生物基聚酰胺生产原料,可以与二元羧酸缩合生成生物基聚酰胺PA5X,其性能可以与石油基聚酰胺材料媲美。生物基聚酰胺以可再生能源为底物,如淀粉、纤维素、植物油等,符合绿色可持续发展战略。1,5-戊二胺的生物合成主要包括微生物从头合成及全细胞催化两种方法,而赖氨酸脱羧酶是其生物合成中的关键酶,该酶主要包括诱导型赖氨酸脱羧酶CadA和组成型赖氨酸脱羧酶LdcC两种。赖氨酸脱羧酶是一种折叠型Ⅰ型磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'' phosphate,PLP)依赖酶,但该酶在实际反应过程中易受环境因素影响,存在活性不高、结构不稳定等问题。因此,提高赖氨酸脱羧酶催化活性及稳定性成为该领域的研究热点,主要包括分子改造以及固定化研究。文中综述了赖氨酸脱羧酶的作用机理、分子改造技术及固定化策略的研究进展,并对未来进一步提升赖氨酸脱羧酶活性及稳定性策略进行了展望,旨在实现1,5-戊二胺的高效生物制备。     

通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc

利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因ldc进行随机突变,在大肠杆菌Escherichia coli JM109中构建赖氨酸脱羧酶突变体库。从E.coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基因cad A和ldc。查询NCBI数据库得知,二者的同源性为75%。分别构建重组质粒p Trc99a-cad A和p Trc99a-ldc,以此2种质粒为模板,经PCR扩增,获得目的基因片段,分析目的基因片段中存在的限制性酶切位点,用多种限制性内切酶碎片化2种基因,切割成不同大小的片段。这些小片段进行不同组合,突变体经过LBXL平板初筛和高效液相色谱(HPLC)复筛,获得1株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体,编号为LDC2-16,其比酶活为4 869.86 U/mg(以1 mg总蛋白计),与2种野生型赖氨酸脱羧酶基因表达的酶Cad A(1 652.63 U/mg)、Ldc(2 365.93 U/mg)相比,在最适温度37℃、p H 6.0时,突变体的比酶活分别是上述野生型酶的2.95和2.06倍。摇瓶发酵5 h后,目标产物1,5-戊二胺产量从46.9提高至63.9 g/L,提高了36%。     

赖氨酸菌种选育初报

赖氨酸是人和动物必需的氨基酸之一,由于机体不能合成,必须经常由食物供给。一般在动物性蛋白质中含量较高,而以谷类为主的食物最易缺乏赖氨酸。赖氨酸主要用于强化食品、动物饲料添加剂,在医疗上可用做复方氨基酸输液和复方赖氨酸制剂等。有关赖氨酸菌种选育,文献上有以高丝氨酸缺陷型或苏氨酸和甲硫氨酸双缺陷型突变株;赖氨酸结构类似物如S—(2—氨基乙基)—L—半胱氨酸(AEC)     

用非水电位滴定法测定L—赖氨酸含量

本测定是L—赖氨酸盐酸盐含量测定法之一。即按非水滴定原理使用自动电位滴定计能够准确简便地测定其含量。     

氧和二氧化碳对番茄后熟的影响

贮藏番茄的气体中,氧分压低于1%时,产生生理损伤。在13—27℃的温度下,7%的氧分压是不能抑制番茄后熟的临界值。在12—14℃的温度下,2—4%的氧分压是长期贮藏番茄的最适条件,可以推迟呼吸高峰的到来。氧分压高到40—50%有一定的催熟作用。乙烯利在27℃和氧分压为0—1%的条件下,没有催熟作用。当氧分压高于2%时,有催熟作用,并可诱导呼吸高峰的提前出现。适当浓度的 CO_2对番茄的后熟有抑制作用,浓度过大则产生毒害作用。CO_2抑制后熟的作用和对番茄的毒害作用与 O_2分压有拮抗。在一定浓度的 CO_2条件下,提高氧分压可减弱CO_2对后熟的抑制和减轻 CO_2对番茄的生理毒害。     

甜菜糖蜜发酵生产L—赖氨酸通过鉴定

甘肃省科学院生物工程中心承担的“甜菜糖蜜发酵生产L—赖氨酸课题于7月27日在兰州通过鉴定。M1083菌株是适合于甜菜糖蜜为碳源的高丝氨酸、亮氨酸双重缺陷兼AEC抗性的L—赖氨酸产生菌。     

测定L—赖氨酸的专用酶电极

自Trichoderma viride Y244—2的L—赖氨酸2—氧化酶固定于明胶载体后,固定在PO_2传感器上。所获酶电极用于连续流动系统,以便测定发酵罐内L—赖氨酸浓度。由于酶载体的性质所定,样品氧含量与信号的关系最小。酶电极的应答(response)确定在0.2mM到0.4mM赖氨酸浓度。用其他氨基酸试验了赖氨酸的特性。赖氨酸电极酶膜可用3000次贮存6个月稳定性良好。     

一株产赖氨酸脱羧酶的菌株Klebsiella pneumoniae sp.GXW-1的鉴定

已有研究表明尸胺可以代替己二胺和己二酸合成新型尼龙,从而解决工业上用石油制取己二胺带来的资源枯竭及环境污染问题,并且尸胺是赖氨酸脱羧酶的产物。本研究通过微生物纯培养技术筛选得到了一株产赖氨酸脱羧酶的菌株GXW-1,完成了该菌株16S rDNA基因鉴定和生理生化特性研究,将其鉴定为Klebsiella pneumoniae sp.。该菌种酶活的最适作用温度为40℃,最适p H为5.4,其酶活为80.46 U,具有较好的生化特性优势。研究表明,金属离子Cd2+和Sr2+可以刺激酶活的提升,而Trition试剂对酶活性也有微弱的激活作用。本研究为以后的工业化生产尸胺提供了思路和依据。     

高赖氨酸的高单系列玉米种子蛋白分析

对含有opaque—2和flour—2基因型的高单系列玉米进行了赖氨酸含量和种子蛋白分析。高单3号的赖氨酸含量比当地品种高出105％,产量高6％。高单系列玉米种子内含赖氨酸高的盐溶和水溶蛋白含量提高了1.6～2.0倍,不含赖氨酸的醇溶蛋白在opaque—2基因型的品种中都减少了一半以上。     

生物基塑料单体5-氨基戊酸的生物合成新途径

5-氨基戊酸(5-aminovalanoic acid,5AVA)可作为新型塑料尼龙5和尼龙56的前体,是合成聚酰亚胺的有前途的平台化合物。目前5-氨基戊酸的生物合成法普遍产率较低且合成过程复杂,成本高。为实现5AVA的绿色生物合成,本研究通过组合表达来自日本白腹鲭(Scomber japonicas)的L-赖氨酸α-氧化酶、来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的α-酮酸脱羧酶和来自大肠杆菌(Escherichia coli)的醛脱氢酶,在大肠杆菌中建立了一条以L-赖氨酸为原料,以2-酮-6-氨基己酸盐为中间产物生物合成5AVA的途径。在葡萄糖浓度为55 g/L,赖氨酸盐酸盐40 g/L的初始条件下,最终消耗158 g/L的葡萄糖和144 g/L的赖氨酸盐酸盐,补料分批发酵产生了57.52 g/L的5AVA,摩尔得率为0.62 mol/mol。与文献报道的以2-酮-6-氨基己酸盐为中间产物的5AVA生物合成途径相比,本文报道的新途径无需使用乙醇和双氧水,且5AVA产量进一步提高。     

赖氨酸高产新菌种FTC—1—6及小试在沪通过鉴定

L—赖氨酸是人体必须的八种基本氨基酸之一。它不能在人和动物体内合成,必须从外界吸收。赖氨酸在动物蛋白质中一般含量较高,但作为我国人民主食的小麦、玉米、大米中,则含量较低。所以适当补加赖氨酸,可以提高我国人民主食的营养价值。儿童发育,妇女妊娠、哺乳     

产L-天冬氨酸α-脱羧酶细菌的分离、鉴定及发酵条件优化

【目的】从葡萄园土壤中分离L-天冬氨酸α-脱羧酶的产生菌株,对其进行分类鉴定,优化其产生L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵条件,为β-丙氨酸的生物合成提供基础。【方法】采用变色圈法和液体复筛培养基分离筛选具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活力的菌株,对菌株进行形态、生理生化特征试验及16S r RNA序列同源性分析鉴定菌株的系统发育学地位,采用单因素及正交设计试验优化培养基及发酵条件。【结果】筛选到一株L-天冬氨酸α-脱羧酶高产菌株Pan D37,其亲缘关系和特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)较近,且形态与培养特征、生理生化特性与特基拉芽孢杆菌基本相符。研究表明其最佳发酵配方和培养条件为:蔗糖22.5 g/L、富马酸7.5 g/L、蛋白胨20 g/L、L-天冬氨酸6 g/L、Triton X-100 2g/L,起始p H为7.0,装液量50 m L/500 m L,摇床转速220 r/min,种子液接种量为5%(V/V),35°C培养28h。在最优条件下L-天冬氨酸α-脱羧酶活力可达44.57 U/m L,比初筛时提高2.57倍。【结论】分离并获得一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)Pan D37,经条件优化后具有较高的L-天冬氨酸α-脱羧酶产生能力,有望应用于β-丙氨酸的工业生产。     

关于谷氨酸棒状杆菌变异株赖氨酸发酵~(13)C核磁共振的研究

<正> ~(13)C核磁共振[NMR]光谱学可应用于谷氨酸棒状杆菌ATCC 21543(一株产生赖氨酸的变异株)赖氨酸生物合成的研究上。此菌株培养在含有[1-~(13)C]葡萄糖或[6-~(13)C]葡萄糖作为唯一碳源的培养基中,并测定其培养液的~(13)C NMR光谱。用~(13)C标记的L-赖氨酸图可由细菌的假设代谢途径得以圆满的解释。对从标记过的基质释放出~(13)CO_2的固定作用和发酵中进行的三     

工业固体糖发酵生产L—赖氨酸

<正> 本文报道用中国科学院微生物研究所L—赖氨酸产生菌株A—77,发酵工业固体糖生产L—赖氨酸的试验研究结果。试验表明,A—77菌株对生长因子要求较高,因此对工业固体糖的发酵产酸能力较差。当添加20%甜菜糖蜜的混合糖为糖源,并提高豆饼水解液的质量时,菌株产酸能力得以充分显示出来。在一般培养条件下,该菌株可在发酵液中积累L—赖氨酸43%,转化率为31.5%,     

蚕氨基酸代谢之研究 Ⅲ.丝腺体L-天门冬氨酸及α-酮戊二酸形成丙氢酸之机制

研究了家蚕(Bombyx mori L.),天蚕蛾科之蓖麻蚕(Philosama cynthia ricini B.)及柞蚕(Antheraea pernyi G.)丝腺体后部自L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸形成丙氨酸的机制。以上各种蚕的丝腺体组织都可利用L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸形成丙氨酸,谷氨酸及CO_2。当存在DL-环丝氨酸(10~(-4)M)时,形成较多的谷氨酸与丙酮酸,而丙氨酸之量显著地减少。以L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸或以L-谷氨酸与丙酮酸为底物,对丙氨酸之形成具有相同的抑制程度。DL-环丝氨酸(10~(-4))并不抑制谷-天转氨酶与草酰乙酸脱羧酶,但在同样条件下,可显著抑制谷-丙转氨酶的活力(～90%)。此外,若以L-天门冬氨酸或其与小量α-酮戊二酸为底物,尤其是用透析后之酶液,并无显著的丙氨酸与CO_2形成。我们认为,自L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸形成之丙氨酸,并非通过Bheemeswar提出的L-天门冬氨酸β-脱羧酶之作用,而是经过三个相继的反应,即在谷-天转氨酶催化下,形成谷氨酸与草酰乙酸,后者除非酶促分解外,在草酰乙酸脱羧酶作用下,形成丙酮酸与CO_2;由以上两反应所形成之谷氨酸与丙酮酸,在蚕丝腺普遍存在的谷-丙转氨酶催化下形成丙氨酸(见图8)。     

细菌鸟氨酸脱羧酶作用的研究进展

多胺是生物体内广泛存在的一类具有多种生物活性的低分子化合物,其合成的关键限速酶是鸟氨酸脱羧酶,鸟氨酸脱羧酶和多胺共同参与生物生长发育等重要生理过程。细菌鸟氨酸脱羧酶在结构上和真核生物略有不同,但是功能类似,其能通过促进多胺的产生发挥对细菌的调节作用。研究发现,细菌鸟氨酸脱羧酶也参与细菌对其他物种的作用,但对人体的作用尚不明确。因此,本文综述了国内外关于细菌鸟氨酸脱羧酶在促进细菌生长、适应环境、抗生素抗性和生物膜形成等方面的作用及相关机制,希望能对细菌鸟氨酸脱羧酶及其作用的后续研究提供一些信息与参考。