应用于电镜生物制样的几项技术

随着电镜技术的不断发展,生物制样方法也日益丰富,虽然透射电镜超薄切片样品制备、扫描电镜常规及“O-D-O”冷冻断裂样品制备等方法已成为规范的手段,并被广为应用,但广大生物工作者对这些规范方法中的个别处理步骤,仍在探索用新的处理技术取代、完善或丰富它们。笔者基于自己工作实践并综合有关文献,对以下几项技术作些介绍。     

植物电子显微镜的负染和投影技术

电子显微镜技术是目前生物学研究中重要的手段之一。运用电镜开展研究,不仅要有高分辨本领的仪器,而且要有精心制备的样品。由于生物样品的电子散射力很低,如不经过特殊处理,样品的反差极弱,观察精细结构几乎不可能。因此,样品制备的质量在利用电镜的研究中具有极其重要的地位。制备样品的技术包括超薄切片、负染、投影、复型等,本文着重介绍负染和投影技术。     

薄层包埋法的改进

薄层包埋法是北京大学胡适宜教授的实验室最先将其应用到植物材料的制作中（胡适宜和徐丽云,１９９３）。它主要是针对一些植物样品如花粉、花粉管和细胞原生质体等在超薄切片制作中较难定位而设计的。由于该方法能准确定位,因而大大提高了这些样品的超薄切片效率和质量...     

低温电镜技术及其在植物（动物）材料研究中的应用

通过一些实例介绍了高压冷冻,冷冻置换和冷冻超薄切片等低温电镜样品制备技术,并且与传统方法对照,说明低温电镜技术的优越性,其中,发菜（Nostoc flagelliforme)营养细胞的冷冻超薄切片（未经化学固定,脱水）所显示的超微结构更客观地反映了生物样品的自然生理状态。此外,应用高压冷冻和冷冻置换的免疫标记电镜技术,首次对发菜营养细胞中的DNA进行定位,明确了核区的位置及范围。     

禾本科植物叶片表皮气孔观察的样品制备方法改良

对现有的禾本科植物叶片气孔观察的样品制作方法中的不足作了一些改良。改良后的方法操作简便、耗时少、样品制备成功率高,且放大后的效果好,不会造成气孔形态的改变。改良方法适用于禾本科植物和其他叶肉紧实不易剥离的植物叶片。50%NaClO处理3min最适用于小麦旗叶表皮样品的制备。     

生物样品冷冻超薄切片技术简介

电子显微镜超薄切片技术的发展开拓了组织学和细胞学的显微和亚显微结构的研究。但由于常规超薄切片术采用强烈化学囿定,有机溶剂脱水和塑料包埋等步骤所带来的结构损伤和分子活性散失等缺点,人们在光学显微冷冻切片和常规超薄切片基础上,近年来发展了冷冻超薄切片制样技术。七十年代初期,商品冷冻超薄切片装置先后问世,进一步促进了这一技术的发展。     

电镜上的生物样品制备技术

电子显微镜为我们提供了很高的分辨本领,使我们能观察到生物样品的超微结构,丰富了人们对微观世界的认识,推动了生物学从细胞水平发展到分子水平。生物超微结构研究的新成就,是跟样品制备技术的不断提高和逐步完善分不开的。但目前已有的样品制备技术还远不能充分利用电镜本身的巨大发展,例如,目前用超薄切片法只能     

介绍一种超薄切片中细胞定位的薄层包埋方法

电子显微技术中,对研究材料中的特定组织或细胞的定位在超薄切片时是最困难的一步。曾提出的用还氧树脂厚切片重新包埋的方法以及类似的厚切片重新粘贴法在克服这一困难上有很好的效果。对于单细胞或分离的原生质体,以及花粉和萌发的花粉管等材料,电镜样品的制作常用离心进行材料的收集、固定、脱水和渗透等步骤,并按寻常的方法     

透射电子显微镜(TEM)在孢粉学研究中的应用

透射电子显微镜作为常规的显微镜工具,已被广泛运用于观察研究生物组织超微构造,20世纪60年代开始在生物化石的研究中得到应用,特别是孢粉学,如大孢子、花粉、疑源类等的研究。通过对处理后的化石样品进行超薄切片,可观察到生物组织中保存下来的有机质壁及内含物的显微构造,对孢粉系统分类学及个体发育学的研究有重要的作用。即使是古生代的或更早期的生物样品也有一些保存下来的有价值的组织可供于超微构造的研究,只是样品在进行前期处理及超薄切片过程中会遇到一些技术问题。文章简要阐述这些具体技术问题。     

辣根过氧化物酶标记与样品后染色联用在微观脑联结组学中的应用

三维电子显微成像(volume electron microscopy)是微观尺度脑联结组学(micro-brain connectomics)研究的主要研究手段.自动卷带式连续超薄切片-收片系统(automated tape-collecting ultramicrotome,ATUM)及扫描电镜序列成像系统的联合应用,是三维电镜成像中一种重要的技术手段.该方法利用卷带式收集超薄切片,形成完整的样品切片库,进而在后续成像中形成样品三维电镜成像数据库.根据ATUM系统镜外切片-收片、保留样本切片库等特点,对相应的生物样品制备方法进行改进,包括树脂配方及树脂渗透方式改良,神经元细胞膜辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)稀疏化标记与样本切片库后染色联用——从而很大程度上减少样品切片的褶皱率,并使得在整体高衬度的样品图像库中高效地识别神经元身份成为可能,最终获得符合脑联结组学所需的高质量成像数据.     

科学出版社新书

病毒的电子显微学技术张景强著主要介绍研究病毒的各种电子显微学方法以及最新进展和取得的成果,内容包括:病毒样品的超薄切片技术,病毒的分离、纯化和病毒样颗粒的组装,病毒免疫电镜技术,生物材料的高分辨率电子显微技术,冷冻电镜单颗粒技术和冷冻电镜电子断层成像技术等。理论介绍尽量做到浅显易懂,书中示例也取自经典的或者最近几年的科研成果。此外,在绪论中简     

应用冷冻割断法研究鱼类卵母细胞生长的制样方法

生物样品制备技术的改进和发展,使扫描电镜能够观察生物组织内部结构1,2;但对生物组织内部结构观察的制样方法多是针对较小细胞组成的实质组织和器官,而对鱼类卵母细胞(尤其是生长和成熟期)这种大型细胞构成的卵巢的制样方法则无报道。本文以越南鱼(Tilapia mossambira)为主,介绍冷冻割断对鱼类卵巢制样,置扫描电镜下观察卵母细胞生长及内部结构变化的方法。       

定量电子束显微分析中生物薄样品的质量损失

对多种生物薄样品和标样进行电子探针X射线能谱显微定量分析,分别以电子束轰击后样品的O Kα峰计数和介于4.2-6.2keV区间的连续X－射线计数变化监测质量损失,结果显示样品O Kα峰计数减少幅度大于连续X－射线计数减少幅度,在相同的分析条件下,各样品质量损失程度不相同（P＜0.05）。培养肝癌细胞冷冻干燥超薄切片、明胶冷冻干燥超薄切片、BSA薄膜、氨基塑料超薄切片、红细胞冷冻干燥超薄切片和卵黄高磷蛋白薄膜样品的质量损失分别为33％、28％、26％、18％、13％和13％,以上结果提示：以O Kα峰计数的减少监测样品的质量损失较敏感,在进行生物薄试样定量EPMA时应对各样品的质量损失进行相应校正。     

神经元单层细胞电镜原位包埋方法的探讨

为探究神经元单层细胞电镜原位包埋方法,该研究以体外培养的大鼠皮层神经元单层细胞为材料,采用了三种不同的方法进行样品制备。结果表明,常规悬浮离心包埋法容易对细胞造成机械损伤,且无法保持原位性;培养在玻璃盖玻片上的细胞,虽能保持较好的原位性,但其超薄切片表层易破碎,遇水溶解,且在透射电镜下可见细胞整体衬度弱和超微结构不完整;而培养在Thermanox塑料薄膜盖玻片上的细胞,可容易观察到相邻细胞间的紧密连接,超微结构清晰,衬度较前组样品好,三维重构之后可很好地显示神经元细胞之间的毗邻关系。因此,相比前两种细胞制样方式,Thermanox塑料薄膜上单层细胞处理过程简便,成功率高。该结果为神经元细胞超微结构的形态学研究进一步提供技术新思路,并有望推动神经元细胞超微结构观察中三维重构技术和光镜/电镜联用技术的开发应用。     

植物树脂半薄切片染色方法的改进

以双子叶植物棉花的幼根、幼茎、叶、胚珠和单子叶植物玉米茎为实验材料,制作树脂半薄切片,对样品染色方法等进行了改进,将蕃红-固绿染色、苏木精-伊红染色、氯化铁-苏木精染色方法系统应用于植物树脂半薄切片制备中,获得了结构完整、染色清晰的棉花各器官和玉米茎半薄切片,建立了一套适合于植物树脂半薄切片制作的染色方法。     

不同扫描电镜制样方法观察棉花叶片气孔

扫描电子显微镜是研究棉花气孔发育及形态建成的重要手段。为了分析常规扫描电子显微镜、环境扫描电子显微镜、冷冻扫描电子显微镜、涂撕法扫描电子显微镜4种方法在棉花气孔观察应用上的优劣,本文通过对棉花叶片取材、制样、镜检,横向对比了这4种方法的取样方式、制样时间和镜检结果。结果表明:常规扫描电子显微镜生物制样时间最长,样品有一定的失水,图片衬度效果最好;环境扫描电子显微镜制样时间最短,样品失水严重,图片衬度较差,样品形态与常规扫描电子显微镜生物制样方法所观察到的形态一致;冷冻扫描电子显微镜制样时间较长,样品未发现失水,图片衬度较差;涂撕法扫描电子显微镜制样时间较短,样品未发现失水,图片衬度较好,但相对于冷冻扫描电子显微镜制样方法而言,其样品呈现出反向的形态,同时由于尖端放电,荷电较多。本研究分析了不同的扫描电子显微镜制样方法适合得到怎样的棉花气孔图片数据,为棉花抗旱相关的基础和应用研究提供了一定的参考。     

快速徒手切片法观察谷子和水稻叶片显微结构

水稻是世界上一半以上人口的主食,且是禾本科植物分子生物学研究的模式植物。谷子是狗尾草属植物,是我国北方重要的杂粮,是典型的C4植物,谷子与水稻基因组共线性很高。对谷子和水稻两种作物的对比研究能够对研发C4水稻提供理论依据。突变体库是研究功能基因组学的重要材料,目前对突变体库的构建技术已经很成熟,但是对目的突变体,尤其是对解剖学方面的突变体材料筛选主要方法是进行石蜡切片,该过程费时费力。本研究旨在改进徒手切片方法对材料进行预筛选,能大大缩减工作量,提高工作效率,该方法得到结构完整、清晰的水稻和谷子叶片徒手切片。     

植物透射电镜样品制备技术探讨

针对植物细胞壁组织坚硬,透射电镜样品的制备难度大的问题,在样品制备过程中逐步改进了常规技术：其中通过延长锇酸固定时间,提高了植物微细结构保存效果;利用减少树脂渗透浓度的方法,改善了树脂包埋头的切割性能.避免了透射电镜观察时,微细结构不清晰和切片破损现象,提高了样品分辨率和观察范围.试验结果表明,此方法能节约透射电镜样品的制备成本、缩短样品制备周期和提高样品制备质量.     

新型捞片器具在昆虫触角连续切片中的应用

【目的】透射电子显微镜技术在生物学研究中发挥着越来越深入广泛的作用,通过透射电镜技术获得生物组织连续切片,从而对其神经网络等延伸结构进行连续追踪及三维重构是非常迫切的科研诉求。但捞片方法的限制使得连续切片的获得困难重重,尤其是对于组织致密的昆虫外骨骼如昆虫触角而言,常因包埋剂浸透不够充分而导致聚合欠佳,增加了连续切片收集的难度。为解决捞取昆虫触角连续切片过程中的系列问题,获得完整、平整的触角连续切片,我们自行研制了一种适用于狭缝载网捞片的组合器具。【方法】用组合器具中的捞样器和放样台分别捞取及放置超薄切片。【结果】捞取的昆虫触角切片不会局部脱离树脂切片而产生不同程度的折叠,不会整片脱离树脂切片而滑落至树脂切片一侧,样品切片完整无破损、无皱褶,连续切片成条贴附在狭缝覆膜区。【结论】新型捞片器具为获得昆虫触角连续切片提供了有力支持。     

植物材料光学和电镜蛋白A-金胶体结合体标记技术

这里介绍一种可在光学显微镜薄切片和电子显微镜超薄切片上标记的技术。我们初步应用这一技术来做燕麦球蛋白的定位,结果是成功的(图版图1,2)。现将操作方法简述如下: 一、样品制备 1.把切成2—3微米~3的新鲜材料,用磷酸缓冲液(pH 7.1)配制的3—4％甲醛(加2.5％蔗糖),在室温固定2小时; 2.用磷酸缓冲液清洗两次,每次30分;