利用雄性生殖细胞建立转基因动物的研究进展

随着科学研究的不断深入及临床治疗的需要,人们对转基因动物的需求越来越大;但是传统的转基因动物技术大多操作复杂、成本高、效率低,从而限制了转基因技术的广泛应用。利用雄性生殖细胞作为载体介导外源基因导入受精卵来建立转基因动物具有操作简便、经济、易于推广的优点,发展前景广阔。该文就利用雄性生殖细胞建立转基因动物的发展历程和方法进行系统的阐述和分析。从利用精子和精原干细胞携带外源DNA两个方向展开,分别分析和评价了恒温共孵育法、脂质体介导法、电穿孔法、胞浆内单精子注射法、输精管注射法、体外转染精原干细胞法以及体内转染精原干细胞法七种实验设计方法。     

转基因动物技术研究综述

较全面介绍了转基因动物的制作方法如显微注射法、精子载体法、YAC载体法、核移植法等,并对研究中出现的制作效率低、外源基因表达不理想、对宿主和环境产生不利影响等问题作了探讨。     

精子载体法制备转基因动物的研究进展

精子载体法是一种低成本、简单快速制备转基因动物的方法.外源基因主要通过两种方式实现基因整合,一种是直接整合到精子的基因组中;另一种是通过精子携带进入卵细胞,然后整合到受精卵的基因组中.尽管现在已经有很多利用精子载体法获得了转基因动物的研究,但是基于精子在受精过程中,结合、内化、以及转运外源基因等方面能力的差异,转染效率仍有待提高.就利用精子载体法制备转基因动物过程中,精子载体法制备转基因动物的分子机制和方法方面进行系统的阐述和分析.     

精子载体法转基因动物的分子机制与制备策略

精子载体法转基因由于具有简便易行、对胚胎发育影响小的特点而成为最具诱惑力的转基因方法之一,因此研究者们在不同的水平上对该方法进行了研究。从分子水平上简要分析了探讨精子结合外源DNA及其内化转运的机制、外源DNA在精细胞内的存在和降解;基于各种理论研究的进展总结了精子载体法制备转基因动物的策略。     

精子介导转基因动物的研究进展

精子是高度分化的细胞,它具有潜在的结合外源DNA并在受精过程中将其转入到卵内的能力。随着受精卵的发育,外源基因将随机整合到受体基因组中,部分基因能在成体中表达,部分基因不仅能表达还能遗传给后代。一旦精子能表达外源基因,那么将很容易得到大量的转基因后代。因此,精子能携带外源基因入卵和产量丰富这两大特性使精子作为载体制备转基因动物成为一个简便的途径。精子载体法制备转基因动物无需昂贵的实验设备,亦无需专门的技术。因此,提出后就备受关注。介绍精子介导的转基因动物的制作原理及具体方法的研究进展。     

胚胎干细胞诱导分化为雄性生殖细胞的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）具有自我更新及无限分化潜能,理论上可以分化为生殖细胞。目前,在人及鼠中已有体外诱导ES细胞分化为成熟精子的报道。系统阐述影响ES细胞分化为雄性生殖细胞的内源性及外源性因素,并结合国内外最新研究进展总结其诱导分化方法,展望应用前景,期望为从事相关研究的学者提供参考。     

日本沼虾雄性生殖细胞原代培养方法

细胞培养方法对于研究虾类疾病、内分泌生理是一种有力的工具。本文介绍了日本沼虾(Macrobrachium nipponense)雄性生殖细胞原代培养的方法。实验发现精原细胞和精母细胞在体外具有较强的分裂能力。通过测定细胞的贴壁率及观察细胞生长情况,初步确定了该类细胞体外培养的最适pH范围为7.2~7.4,渗透压范围为400~500mmol/L。     

转基因农用动物

<正>前言 自人成为农牧民以来,就不断地试图改良牲畜品种和生产率,这本来是生存所要求,而现今是商业上所迫切需要的。传统的培养方法是以选择具有所需要特性的动物为基础,一段时间来,此法受到人工受精和相关参数统计分析技术应用的帮助而得到改进。尽管传统方法有效而且是成功的,但就其本质来说,仍然是逐渐前进的。近来经济和消费者的要求表明家畜生产率和品种都需要量变。例如,     

多能干细胞向雄性生殖细胞定向分化的研究进展

生殖健康是生命科学领域关注的核心之一,各种原因所致男性不育亟待解决,然而由于伦理限制等原因,缺少合适的具有人类遗传背景的研究模型开展研究。胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）均属于多能干细胞,具有多向分化潜能。一方面,可利用ESCs?/?iPSCs向生殖细胞分化的模型研究人类生殖细胞的发育规律,另一方面,在此基础上,可建立带有人类疾病遗传背景的iPSCs模型,体外诱导其向雄性生殖细胞分化,利用该模型研究男性不育的发病机制。由于精子在体内的形成遵循一定规律,体外环境中不同发育阶段的生殖细胞在不同诱导因子作用下才可稳定地往下一阶段定向分化,因此,诱导ESCs?/?iPSCs向雄性生殖细胞方向分化时,诱导因子的种类和加入时间的选择应根据生殖细胞的体内发育特征而定,并且在诱导的不同阶段循序加入,以此模拟精子在体内的形成过程,进而更好地研究男性不育的发病机制。本文将对多能干细胞向雄性生殖细胞定向分化的常用诱导因子及存在问题和展望进行综述,为相关研究的开展提供借鉴。     

转基因植物生产动物疫苗的研究及应用

转基因植物生产动物疫苗的研究及应用范国昌１,２山松１钱凯先２沈桂芳１（１．中国农业科学院生物技术研究中心,北京１０００８１）（２．浙江大学生物科学与技术系,杭州３１００２７）ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｎＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎ...     

抑制糖酵解活性限制雄性原始生殖细胞的增殖

目的:雄性原始生殖细胞在植入生殖嵴后,会从有丝分裂退出进入静息状态,在这一过程中伴随着细胞内代谢状态的改变,本研究旨在体解析原始生殖细胞增殖的改变与细胞代谢之间的因果关系。方法:通过体内Brdu掺入实验明确不同时间点雄性生殖细胞的增殖状态;分析比较增殖状态和静息状态原始生殖细胞糖酵解相关基因的表达;利用腹腔注射HK2特异性抑制剂2-Deoxy-D-glucose (2-DG),构建糖酵解抑制小鼠模型;通过免疫荧光与qPCR分析抑制糖酵解后原始生殖细胞的表型。结果:免疫荧光结果显示雄性生殖细胞增殖停滞从E13.5开始,至E15.5完全停滞;qPCR和Western Blot显示在此过程中HK2的表达是逐渐降低的;在E11.5抑制小鼠胚胎中的糖酵解过程,可以在E13.5检测到雄性PGCs增殖下降,并且可以抑制多能性基因如Sox2、Oct4的表达。结论:研究发现,E11.5-E13.5雄性原始生殖细胞内增殖与多能性的维持需要糖酵解。改变胚胎糖酵解水平可以影响原始生殖细胞增殖分化进程。     

Lanosterol metabolism and sterol regulatory element binding protein (SREBP) expression in male germ cell maturation

Expression of genes involved in cholesterol biosynthesis in male germ cells is insensitive to the negative cholesterol feedback regulation, in contrast to cholesterol level-sensitive/sterol regulatory element binding protein (SREBP)-dependent gene regulation in somatic cells. The role of sterol regulatory element binding proteins in spermatogenic cells was an enigma until recently, when a soluble, 55 kDa cholesterol-insensitive form of SREBP2 (SREBP2gc) was discovered [Mol. Cell. Endocrinol. 22 (2002) 8478], being translated from a germ cell-specific SREBP2 mRNA. Our RT-PCR results also show that SREBP2 as well as SREBP1c mRNAs are detectable in prepubertal and postpubertal male germ cells while SREBP1a is not detected. Surprisingly, three SREBP2 immunoreactive proteins (72, 63 and 55 kDa), that are not present in mouse liver nuclei, reside in testis nuclei of prepubertal and adult mice. The 55 kDa protein is likely SREBP2gc, the other two isoforms are novel. HPLC measurements in liver and testes of fasted prepubertal and postpubertal mice showed no significant difference in cholesterol level. However, FF-MAS and lanosterol/testis-meiosis activating sterol (T-MAS) intermediates that are detectable mainly in testes, increase in fasted postpubertal mice which coincides well with the elevated level of 68 kDa SREBP2. Similar to SREBP2gc, the two novel SREBP2 immunoreactive proteins seem to be insensitive to the level of cholesterol.     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用DIG末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异(P<0.01),平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胚胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。     

Detection of changes in the nuclear phase and evaluation of male germ units by flow cytometry during in vitro pollen tube growth in <Emphasis Type="Italic">Alstroemeria aurea</Emphasis>

This study aimed to analyze male gamete behavior from mature pollen to pollen tube growth in the bicellular pollen species Alstroemeria aurea. For mature pollen, pollen protoplasts were examined using flow cytometry. The protoplasts showed two peaks of DNA content at 1C and 1.90C. Flow cytometry at different developmental stages of pollen tubes cultured in vitro revealed changes in the nuclear phase at 9 and 18 h after culture. Sperm cell formation occurred at 6–9 h after culture, indicating that the first change was due to the division of the generative cells into sperm cells. After sperm cell formation, the number of vegetative nucleus associations with sperm cells showed a tendency to increase. This association was suggested as the male germ unit (MGU). When sperm cells, vegetative nuclei, and partial MGUs were collected separately from pollen tubes cultured for 18 h and analyzed using a flow cytometer, the sperm cells and vegetative nuclei contained 1C DNA, while the DNA content of partial MGUs was counted as 2C. Therefore, the second change in the nuclear phase, which results in an increase in 2C nuclei, is possibly related to the formation of MGUs.     

黄鳝性腺自然逆转过程中vasa基因的表达分析

本研究采用RNA反义探针原位杂交技术,对vasa基因在黄鳝(Monopterusalbus)性腺发育过程中的表达情况进行了分析。结果表明:vasamRNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期卵母细胞的胞质中均匀分布,在Ⅳ、Ⅴ期卵母细胞中vasamRNA有向胞质外周皮层迁移集中的趋势,但不明显;退化的卵粒也呈现vasamRNA阳性反应;在Ⅲ、Ⅳ期卵巢的被膜中检测到带有vasa阳性信号的细胞,这些细胞可能是待向精原细胞分化、迁移到卵巢被膜上的原始生殖细胞(Primordialgermcell,PGC),在性逆转过程中这些PGC可能由卵巢被膜迁移到精小叶中并发育成精子;在成熟精巢中,vasa在精原细胞和初级精母细胞中表达。进一步采用碱性磷酸酶染色法分析黄鳝卵巢及精巢后发现:在卵巢中,除了卵母细胞外,卵巢被膜中也检测到了带有碱性磷酸酶阳性信号的细胞;在成熟精巢中,只在生殖腺囊内的雄性生殖细胞中检测到碱性磷酸酶,而精巢被膜中没有检测到带有碱性磷酸酶阳性信号的细胞。本研究结果初步表明:黄鳝的雄性生殖细胞可能起源于雌性阶段卵巢被膜中的原始生殖细胞[动物学报51(3):469-475,2005]。     

表达barstar基因及bar基因的转基因油菜的研究

从细菌Ｂａｃｉｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ染色体ＤＮＡ中克隆了ｂａｒｎａｓｅ抑制剂ｂａｒｓｔａｒ的基因,构建了带有ＴＡ－２９基因５′调控区（－１３００－＋３）与ｂａｒｓｔａｒ基因编码区、ＣａＭＶ３５Ｓ启动子与除草剂抗性基因ｂａｒ两个表达框架的植物表达质粒ｐＢＢＳ。以“双低”油菜“５－４”的子叶柄为受体,通过农杆菌介导的遗传转化,获得了在含有１０ｍｇ／Ｌ卡那霉素和２０ｍｇ／ＬＰＰＴ的筛选培养基上再生的转基因植株。ＰＣＲ分析结果表明,ｂａｒｓｔａｒ基因已整合到油菜染色体上;Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,ｂａｒｓｔａｒ基因及ｂａｒ基因在转基因植物中得到了正确的调控与表达。以转基因油菜“５－４”为父本授粉给表达ｂａｒｎａｓｅ基因的雄性不育植株,不育株能正常结实。     

Production of human CD59-transgenic pigs by embryonic germ cell nuclear transfer

This study was performed to produce transgenic pigs expressing the human complement regulatory protein CD59 (hCD59) using the nuclear transfer (NT) of embryonic germ (EG) cells, which are undifferentiated stem cells derived from primordial germ cells. Because EG cells can be cultured indefinitely in an undifferentiated state, they may provide an inexhaustible source of nuclear donor cells for NT to produce transgenic pigs. A total of 1980 NT embryos derived from hCD59-transgenic EG cells were transferred to ten recipients, resulting in the birth of fifteen piglets from three pregnancies. Among these offspring, ten were alive without overt health problems. Based on PCR analysis, all fifteen piglets were confirmed as hCD59 transgenic. The expression of the hCD59 transgene in the ten living piglets was verified by RT-PCR. Western analysis showed the expression of the hCD59 protein in four of the ten RT-PCR-positive piglets. These results demonstrate that hCD59-transgenic pigs could effectively be produced by EG cell NT and that such transgenic pigs may be used as organ donors in pig-to-human xenotransplantation.