人骨形态发生蛋白-2重组腺病毒的构建与制备

将人BMP-2的编码区cDNA克隆至穿梭载体pShuttle,以PI-SceI和I-CeuI切下含BMP-2编码区cDNA的片断,在体外与PI-SceI/I-CeuI切开的腺病毒DNA连接,构建重组有BMP-2全长编码区基因的腺病毒DNA,PCR鉴定正确后,经PacI酶切线性化,在脂质体介导下转染HEK293细胞,反复冻融制备重组腺病毒,空斑形成试验测定病毒滴度约为7.5×106～1.5×107pfu/ml。以BMP-2重组腺病毒感染体外培养的小鼠成肌细胞C2C12,Westernblot检测证实有BMP-2表达。     

采用Gateway^TM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体

目的：采用基于attLXattR的入噬茵体位点特异性重组系统的Gateway^TM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体（Ad—hBMP-2）。方法：从pcDNA3．1质粒中获取目的基因hBMP-2片段,连入带attL1、attL2位点的入门载体pENTRTM11中,形成入门克隆,将入门克隆与带attR1、attR2位点的目的载体Ad／CMV／V5-DEST在高效重组酶作用下发生体外重组形成表达克隆ad—BMP-2,经鉴定将ad—BMP-2线性化后转入293A细胞包装,通过细胞裂解法获得人骨形态发生蛋白-2的基因重组腺病毒珠Ad-hBMP-2,将其扩增,采用western blotting技术分析目的蛋白表达。结果：经酶切及测序证实目的基因BMP-2片段按正确方向重组入目的载体中,带BMP-2的目的载体在293A细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,测得病毒滴度为2.5×10^9pfu／ml,western blotting结果证实Ad—hBMP-2在293A细胞中高效表达hBMP-2蛋白。结论：本实验首次利用基于入噬菌体的位点特异性重组系统的Gateway^TM技术成功构建了Ad—hBMP-2,该技术与传统构建方法比较具有高效性和灵活性,为进一步研究BMP-2的生理功能和利用BMP-2进行骨基因治疗奠定了实验基础。     

重组人骨形态发生蛋白-7与脱钙骨基质复合物双重骨诱导作用的生物学评价

将不同剂量的重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)与脱钙骨基质(DBM)分别复合后,植入小鼠股部内侧肌间隙,三周后取材,通过组织学检查、碱性磷酸酶(ALP)及钙含量的测定比较各组的骨诱导活性。结果显示,三组复合物均有骨组织生成,中、高剂量组可见骨小梁、板层骨和原始骨髓腔,血管和骨髓丰富;低剂量组的成骨量明显少于中、高剂量组,且新骨的成熟度低于其他两组,DBM少部分吸收;单独植入rhBMP-7组有编织骨形成;而DBM组可见成骨细胞的聚集。rhBMP-7/DBM复合组在ALP和Ca含量水平上与同等剂量的两对照组相比均有显著性差异(P<0.01),而rhBMP-7三种剂量之间均有显著性差异(P<0.01)。这充分说明DBM作为rhBMP-7的合适载体,具有缓释作用,且二者复合可起到双重骨诱导活性;而且rhBMP-7的骨诱导活性具有一定的剂量依赖性。     

离子交换色谱法对大肠杆菌表达的人重组骨形态发生蛋白-7的纯化

重组大肠杆菌高量表达重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7),每升培养液约得到湿菌体3g,其中目的蛋白约占菌体总蛋白量的40％。裂解离心,用低浓度变性剂洗涤初步纯化包涵体,上清中无目的蛋白损失;将包涵体溶解于高浓度变性剂溶液中,目的蛋白纯度提高到60％;然后在不同条件下用离子交换色谱法对变性状态下的蛋白质进行纯化,绝大部分杂蛋白被除去,目的蛋白纯度达95％以上;改变条件,可以减少rhBMP-7损失;用Western blot对目的蛋白进行特异性鉴定。     

重组人骨形态发生蛋白-6的表达、纯化及其活性分析

利用RT-PCR从人胎盘组织中获取BMP-6成熟肽的cDNA 片段,并克隆到表达载体pET-15b中, 构建hBMP_6成熟肽的非融合蛋白表达质粒pET-BMP6,转化E.coli BL21（DE3）。IPTG 诱导4h后,工程菌高表达rhBMP-6成熟肽,在SDS-PAGE上出现预期的新蛋白带(≈15kD), 约占菌体总蛋白的10%,表达产物以包涵体形式存在。分离和纯化的包涵体溶解于8 mol/L尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,得到目的蛋白纯度达95%以上。再经稀释复性后,约80%的rhBMP-6形成同源二聚体。体外活性分析结果显示：rhBMP-6可以提高C3H10T1/2 细胞碱性磷酸酶活性及促进I型胶原、Osterix（Osx）和骨钙素（Osteocalcin）等成骨细胞表型转化标记基因mRNA的表达,证明制备的rhBMP_6具有诱导非骨源性细胞分化成为成骨细胞的作用。     

重组人骨形态发生蛋白2在CHO细胞中的表达、鉴定及活性分析

构建真核表达载体pCDNA3.1( )-hBMP-2,与质粒pSV2-dhfr共转染CHO-dhfr-细胞,以含有700μg/mLG418的IMDM进行选择性培养,筛选抗性克隆,并用MTX扩增,提高rhBMP-2的表达量。收集的rhBMP-2蛋白进行Westernblot检测,还原蛋白样品电泳产生一条大小约为18kD的特异性条带,非还原蛋白样品电泳产生一条大小约为30kD的特异性条带,提示表达的rhBMP-2是经过糖基化修饰的,且以同源二聚体形式分泌表达。单细胞分离培养得到14株rCHO(hBMP-2)单克隆细胞株,ELISA法检测rhBMP-2表达水平,最高可达7.83μg/24h/106cells。活性分析结果表明,表达的rhBMP-2具有很强的生物学活性。     

表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的:研究表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵和表达产物的纯化工艺。方法:利用16L发酵罐发酵培养工程菌,设定了溶氧、搅拌速度、诱导时机、补料和培养基pH值等发酵条件;通过包涵体洗涤、离子交换层析法纯化目的蛋白。结果:工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的30%以上,纯化后目的蛋白的纯度可达98%。结论:建立了大肠杆菌高效表达人骨形态发生蛋白-7的发酵及纯化工艺。     

采用GatewayTM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体

目的:采用基于attLXattR的λ噬菌体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒栽体(Ad-hBMP-2).方法:从pcDNA3.1质粒中获取目的基因hBMP-2片段,连入带attL1、attL2位点的入门载体pENTRTM11中.形成入门克隆,将入门克隆与带attR1、attR2位点的目的载体Ad/CMV/V5-DEST在高效重组酶作用下发生体外重组形成表达克隆ad-BMP-2,经鉴定将ad-BMP-2线性化后转入293A细胞包装,通过细胞裂解法获得人骨形态发生蛋白-2的基因重组腺病毒珠Ad-hBMP-2,将其扩增,采用western blotting技术分析目的蛋白表达.结果:经酶切及测序证实目的基因BMP-2片段按正确方向重组入目的载体中,带BMP-2的目的栽体在293A细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,测得病毒滴度为2.5×109pfu/ml.western blotting结果证实Ad-hBMP-2在293A细胞中高效表达hBMP-2蛋白.结论:本实验首次利用基于λ噬菌体的住点特异性重组系统的GatewayTM技术成功构建了Ad-hBMP-2,该技术与传统构建方法比较具有高效性和灵活性,为进一步研究BMP-2的生理功能和利用BMP-2进行骨基因治疗奠定了实验基础.     

重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性

报告了人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的基因克隆,及其在大肠杆菌中的表达。用ＡｆｌⅡ酶剪除ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ中的信号肽及前肽部分的序列,将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３′端０．３６ｋｂ基因片段克隆于大肠杆菌表达载体ｐＭＸ－１质粒的ＡＴＧ下游,受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经４２℃６ｈ诱导后,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新蛋白带,分子量约为１２ｋＤ,约占菌体总蛋白的２０％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后,可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白－２成熟肽（ｒｈＢＭＰ－２ｍ）。小鼠肌肉植入试验发现。ｒｈＢＭＰ－２ｍ植入后的不同时间,在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成,证明ｒｈＢＭＰ－２ｍ具有明显的诱导新骨形成的作用。     

人骨形成蛋白-2C端102肽的诱骨活性

为分析更短的Hbmp-2C端肽是否具有诱骨活性 ,寻求新型的有诱骨活性的基因工程Hbmp-2产品。利用温度诱导的大肠杆菌表达系统表达肽段长度为102个氨基酸的Hbmp-2C端肽及其Cys的突变体。表达产物经纯化复性后 ,植入小鼠肌袋模型中测试其诱骨活性。获得了能稳定表达Hbmp 2C端肽的工程菌 ,测序结果与预期的序列完全一致。表达产物以包涵体形式存在 ,表达量占细胞总蛋白的 3 0 %。产物经纯化复性后 ,小鼠肌袋模型测试结果表明 :Hbmp 2 10 2肽仍具有诱骨活性 ,而将C端第一位Cys突变的 10 2肽诱骨活性丧失。实验表明 :比Hbmp 2成熟肽 ( 114个氨基酸 )更短的C端 10 2肽仍具有良好诱骨活性 ,这 10 2肽N端第一个Cys对其诱骨活性可能是必需的。     

人骨形成蛋白-7成熟肽基因在巴斯德毕氏酵母中的分泌表达

目的:利用甲醇酵母表达系统,构建重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽的基因工程菌,并实现其分泌表达。方法:采用PCR方法,依据GenBank数据库中hBMP-7成熟肽序列(AccessionNo.NM_001719)设计并合成一对引物,从已构建的含hBMP-7的克隆载体中扩增获得人骨形成蛋白-7成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,电转化巴斯德毕氏酵母SMD1168,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,经筛选获得rhBMP-7成熟肽表达株,并进行了表达产物的活性测定。结果:表达产物存在于培养上清中,约占分泌蛋白总量的8%。经Western印迹分析可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性。结论:构建了重组人骨形成蛋白-7成熟肽的基因工程菌并在甲醇酵母中实现了分泌表达,为进一步的活性及功能研究奠定了基础。     

重组人骨形态发生蛋白-7表达系统研究进展

骨形态发生蛋白-7（BMP-7）在胚胎发育、肾脏保护、骨形成、代谢、再生等各个方面发挥着重要的作用,现已进入了临床应用阶段。我们简要综述了重组人BMP-7（rhBMP-7）的原核表达系统及真核表达系统,并对各表达系统的优缺点进行了分析。     

定量测定重组人睫状神经营养因子活性的新方法

目的：建立一种能定量测定重组人睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor,CNTF）生物学活性的新方法。方法：从鸡胚中分离出背根神经节并制成神经细胞,将重组人睫状神经营养因子加入到细胞中继续培养64h后,用酸性磷酸酶法检测活细胞内酸性磷酸酶的活性,从而定量测定重组人睫状神经营养因子的生物活性。结果：重组人睫状神经营养因子有促原代鸡胚背根神经细胞存活作用,细胞存活率与加入重组人睫状神经营养因子的量成正相关。结论：通过检测存活的原代鸡胚背根神经细胞内酸性磷酸酶的含量来定量测定重组人睫状神经营养因子生物活性的实验方法具有干扰因素少、定量准确、重复性好等优点。     

重组人KGF制备工艺和活性检测方法的建立

目的:在毕赤酵母中实现了KGF的高效表达,并初步建立了生物学活性检测方法.方法:合成5'端缺失69个核苷酸的KGF基因序列,克隆入pPIC9并转化毕赤酵母菌株GS115中,经诱导表达.发酵液上清采用脱盐层析和阳离子交换层析进行分离纯化.利用貂肺上皮细胞(Mv-1-Lu)检测其生物学活性.结果:表达水平达到了110mg/L发酵液;表达产物经一步离子交换层析就能得到有效分离,总收率在50mg/L发酵液以上;纯化的rhKGF生物学活性与KepivanceTM相当.结论:rhKGF制备工艺和检测方法的建立将为该因子的规模化生产和进一步的临床应用提供良好基础.     

重组人半乳凝集素-1的原核表达、纯化及生物活性检测

目的:在大肠杆菌中表达半乳凝集素-1(galectin-1),并进行纯化及生物活性检测。方法:将人半乳凝集素-1基因克隆至带有His融合标签的原核表达载体pQE-30上,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析纯化后,进行Western印迹鉴定,并用红细胞凝集试验检测其生物学活性。结果:双酶切鉴定和核苷酸序列测定表明重组表达质粒pQE-30-Galectin-1构建正确;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,且具有良好的红细胞凝集活性。结论:在大肠杆菌中表达了重组人半乳凝集素-1,且具有良好的生物活性。     

猪骨髓基质抗原2基因的克隆、表达及生物学活性研究

研究目的是克隆猪骨髓基质抗原2(Bone marrow stromal antigen-2,BST-2)基因并进行真核表达,获得具有抗病毒活性的重组BST-2蛋白。研究通过RT-PCR从猪瘟弱毒疫苗和聚肌胞(Poly I:C)刺激的猪肾细胞(PK-15)中扩增出猪BST-2cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,构建重组表达质粒pcDNA-BST-2,转染HEK293T细胞,纯化BST-2蛋白并经Bradford法定量,Western blot检测,研究BST-2抗病毒生物学活性。酶切鉴定和核酸序列测定证实pcDNA-BST-2真核表达质粒构建成功,转染HEK293T细胞后,经间接免疫荧光能够检测到绿色荧光。生物学活性测定重组BST-2蛋白具有一定的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)、H9禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)及猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,PRRSV)的活性。结果表明,重组BST-2具有一定抗病毒生物功能,为进一步研究重组BST-2蛋白的活性以及BST-2抗病毒药物研究奠定了基础。