模拟微重力条件下心肌细胞的体外三维固定化培养

观察心肌细胞体外培养形成三维(3D)组织结构的能力和过程及心肌细胞在模拟微重力状态下的3D固定化培养效果。应用酶消化法从新生的乳鼠心室肌组织获取心肌细胞,以Cytodex3为心肌细胞的3D固定化培养载体,将心肌细胞固定化培养于Spinnerflask中,用扫描电镜观察心肌细胞体外培养形成的3D组织结构;以心肌细胞的代谢效率和细胞搏动强度为观察指标,比较心肌细胞在Spinnerflask及HARV(highaspectratevessel)生物反应器中3D固定化培养的差异。结果显示,心肌细胞不仅能贴附于Cytodex3上生长,且形成了具有同步自律收缩的3D组织样结构;心肌细胞在两种不同培养体系中的细胞接种效率和细胞形态没有明显差异,培养于HARV中的心肌细胞的代谢效率和细胞搏动强度均明显高于Spinnerflask培养体系。体外培养的乳鼠心肌细胞具有形成同步自律收缩的3D组织结构的能力;模拟微重力的培养环境有利于改善心肌细胞3D组织样培养物的代谢和功能 。     

成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的探讨成年小鼠心肌细胞分离培养的方法,评价心肌细胞的存活状况。方法应用改良Langendorff方法进行成年小鼠心脏灌流,分离并培养心肌细胞,评价杆状心肌细胞的比例变化。台盼蓝染色判定心肌细胞活力,应用毒胡萝卜素(thapsigargin)治疗心肌细胞24 h后,WST方法测定细胞生存率。结果在每个成年小鼠心脏分离了40~60万的心肌细胞,台盼蓝染色结果68%为存活心肌细胞。心肌细胞培养1 h2、4 h及48 h后,杆状心肌细胞的比例分别为70%、50%及30%。心肌细胞生存率随着毒胡萝卜素浓度的增加逐渐减低,其中1、5及10μmol/L毒胡萝卜素的生存率明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论应用改良Langendorff方法及严格控制心脏灌流培养的条件,可以成功地分离培养成年小鼠心肌细胞,有助于进行细胞分子水平的研究。     

磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002对缺血缺氧心肌细胞的作用研究

目的:明确P13K/Akt信号通路在缺血缺氧心肌细胞损害中的作用。方法:建立心肌细胞缺血缺氧模型,施加磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002干预,观察心肌细胞活力、培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量及碘化丙啶(PI)染色阳性细胞比例的变化。结果:模拟缺血缺氧后细胞活力下降,LDH及PI染色阳性细胞比例显著增加。LY294002干预复合缺血缺氧后,细胞活力急剧下降,LDH含量及PI染色阳性细胞比例进一步显著增加(P<0.01)。结论:应用LY294002加重了缺血缺氧对心肌细胞的损伤效应,提示PI3K/Akt通路参与了缺血缺氧心肌细胞的内源性保护反应,减轻了缺血缺氧损害。     

外源性精胺对缺氧诱导乳鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制

目的：观察外源性精胺对缺氧所致的乳鼠心肌细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法：复制原代培养乳鼠心肌细胞缺氧损伤模型（使用pH=6.8的Hank's平衡盐溶液作为细胞培养基,排出氧气,然后在缺氧箱中培养24 h）,细胞随机分为正常对照（Control）组、缺氧（Hypoxia）组和精胺干预（Hypoxia+Sp）组。Western blot检测心肌细胞多胺代谢关键酶（ODC、SSAT）蛋白质表达;CCK-8,Hoechst 33342染色观察细胞凋亡情况;光吸收法检测细胞（或培养液）内T-SOD和Caspase-3/-9活性,MDA、GSH含量;DCFH-DA染色观察细胞内活性氧（ROS）生成。结果：与正常组相比,Hypoxia组SSAT蛋白质表达、细胞凋亡率、MDA含量以及细胞内ROS生成增加,而ODC蛋白质表达、SOD活性、GSH含量降低;与Hypoxia组比较,Sp处理可减轻上述指标的变化。结论：外源性精胺可减轻缺氧引起的乳鼠心肌细胞损伤和凋亡,其机制与恢复多胺稳态和清除活性氧有关。     

细胞外基质对体外培养心肌细胞铺展作用的影响

本研究用分离的新生大鼠心肌细胞,观察不同的细胞外基质,在培养不同时间对心肌细胞铺展的影响。结果表明,不同的细胞外基质影响心肌细胞铺展,在培养8小时即出现差别,48小时差异明显,其中FN促进心肌细胞铺展,而FN的片段延缓心肌细胞的铺展。     

培养心肌细胞肾上腺素能受体的研究

自1960年Harary用胰酶消化分散新生大鼠单个心肌细胞培养成功以后,其他学者相继培养成功大鼠胎鼠和人胚分散心肌细胞。我国学者参照Harary的方法于1981年培养大鼠乳鼠单个心肌细胞成功,有的学者还于1983年观察了β受体药物异丙肾上腺素和心得安对心肌细胞搏动频率的影响。 为了研究单个心肌细胞和其它细胞混合培养时,心肌细胞和其它细胞形态分化和化学分化     

大鼠脂肪组织来源的间充质干细胞向心肌样细胞分化的细胞特征

目的探索大鼠脂肪组织来源的间充质干细胞(ADMSCs)向心肌细胞定向诱导分化的细胞特征。方法胰酶消化法分离出ADMSCs,对培养第3代细胞分别进行HE染色和CD44免疫细胞化学染色,利用光镜和激光共聚焦扫描显微镜观察其细胞特征和CD44的表达;5-氮杂胞苷(5-aza)诱导,应用肌球蛋白重链(MHC)抗体进行免疫细胞化学染色,鉴定分化后的心肌样细胞;利用免疫组织化学观察脂肪组织中CD44阳性细胞的表达分布。结果大鼠脂肪组织分离的细胞生长迅速,培养后分为两类:一类为大型细胞,其数量较多、体积较大;另一类为小型细胞,其数量较少、体积较小。免疫细胞化学和激光共聚焦显微镜观察显示大细胞呈CD44弱阳性反应,小细胞呈强阳性反应。5-aza诱导后,发现7处细胞团明显分化为心肌样细胞,肌球蛋白呈强阳性反应。HE染色显示呈典型的心肌细胞的特征。脂肪组织中CD44阳性细胞位于脂肪小叶之间,数量较少,形态较小。结论培养的大鼠脂肪组织来源的ADMSCs分为大、小两类,小型细胞可能具有较强的分化为心肌样细胞的能力。     

1-磷酸鞘氨醇促进间充质干细胞向心肌分化

为研究1-磷酸鞘氨醇 (Sphingosine-1-phosphate,S1P) 对脐带间充质干细胞 (Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs) 和脂肪间充质干细胞 (Adipose derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs) 向心肌分化的影响,探索其适宜的作用时间和浓度,将UC-MSCs和AD-MSCs接种到培养板,用添加不同浓度S1P的心肌细胞培养液诱导两种干细胞向心肌分化,诱导时间分为7 d、14 d和28 d。采用免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白,α-肌动蛋白 (α-actin)、缝隙连接蛋白 (Connexin-43) 以及肌球蛋白重链 (MYH-6) 的表达,并通过共聚焦显微镜和荧光显微镜进行观察;采用MTT分析细胞的活性;膜片钳检测分化细胞的钙瞬变 (此为心肌细胞的功能性指标)。结果表明,S1P与心肌细胞培养液协同作用,能够促进UC-MSCs和AD-MSCs向心肌细胞的分化。并且,随着S1P浓度的增加,促分化作用增强,但细胞活性降低。S1P在心肌细胞培养液中的适宜作用时间为14 d,适宜作用浓度为0.5 μmol/L。而且联合心肌细胞培养液可以使UC-MSCs和AD-MSCs的心肌分化细胞产生钙瞬变,具有类似心肌细胞的功能性。S1P能够与心肌细胞培养液协同作用,促进UC-MSCs和AD-MSCs的心肌功能性分化。     

PUMA对高糖诱导的大鼠H9C2心肌细胞凋亡的作用及机制

目的:观察促凋亡蛋白p53上调凋亡调控因子(PUMA)在高糖所致H9C2心肌细胞凋亡中的作用及机制。方法:H9C2心肌细胞随机分为对照组(使用5.5mmol/L葡萄糖作用于细胞)和高糖组(使用35 mmol/L葡萄糖作用于细胞,HG组)分别刺激6 h, 12 h, 24 h和48 h,每组设复孔5个,TUNEL染色检测细胞凋亡率;RT-PCR及Western blot法分别测定PUMA mRNA及蛋白表达情况;JC-1法检测线粒体膜电位;Western blot测定caspase-3表达和细胞色素c(Cyt C)释放。H9C2细胞随机分为四组,对照组、高糖(35 mmol/L)、HG+si-scramble组(使用si-scramble转染心肌细胞24 h,使用35mmol/L葡萄糖作用于细胞)和Si-PUMA组(使用si-PUMA转染心肌细胞24 h,使用35mmol/L葡萄糖作用于细胞),观察抑制PUMA表达对高糖诱导细胞凋亡率、线粒体膜电位、Cyt C的影响。结果:与对照组相比,高糖刺激心肌细胞组TUNEL染色阳性率、活化caspase-3和PUMA表达明显升高(P<0.0...     

细胞外间质-整合素在牵张刺激心肌细胞肥大中的作用

应用牵张刺激培养细胞的模型 ,观察胶原、纤维连接蛋白、层粘连素对牵张刺激心肌细胞肥大的影响 ,探讨细胞外间质 -整合素受体在超负荷心肌肥大的跨膜信号传导机制中的作用。结果发现 ,胶原、纤维连接蛋白、层粘连素明显有助于培养心肌细胞的贴壁、伸展。牵张刺激后 ,胶原、纤维连接蛋白基质组心肌细胞的 3H -亮氨酸掺入率和心肌细胞表面积均显著大于对照组 ,而层粘连素组无显著变化 ;可溶性纤维连接蛋白、RGD肽均可显著抑制牵张刺激诱导的培养心肌细胞 (胶原为粘附基质 )的3H -亮氨酸掺入率升高和心肌细胞表面积增大 ,而层粘连素无明显作用。结果表明 ,特异的细胞外间质 -整合素在超负荷心肌肥大机制中发挥了跨膜信号传导作用。     

骨髓基质干细胞向心肌细胞诱导分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞在体外和体内向心肌细胞诱导分化的能力,为下一步的细胞移植治疗心肌梗死提供实验基础.方法体外诱导实验中,将不同浓度的5-氮胞苷作用于不同培养时间的骨髓基质干细胞,摸索5-氮胞苷的最佳诱导时机和浓度,观察诱导后细胞形态变化,并用免疫细胞化学染色检测心肌特异性肌钙蛋白T的表达;在体内实验中,培养扩增的骨髓基质干细胞经BrdU标记后,自体移植于正常心肌内,分别通过BrdU和心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测移植细胞的存活和分化情况.结果体外诱导实验中,5-氮胞苷的诱导作用以10μmol/L的浓度对传代细胞进行两次诱导,效果最好,不仅能诱导出表达心肌特异蛋白的心肌样细胞,而且这些细胞在体外能够自发搏动.体内诱导实验中,移植的细胞在正常心肌微环境中能够存活并分化为心肌细胞.结论骨髓基质干细胞在体外化学诱导和体内心肌微环境诱导时均能分化为心肌细胞,可用于细胞移植治疗心肌梗死的实验.     

细胞外间质-整合素在牵张刺激心肌细胞肥大中的作用

应用牵张刺激培养细胞的模型,观察原原、纤维连接蛋白、层粘连素对牵张刺激心肌细胞肥大的影响,探讨细胞外间质－融洽纱受体在超负荷心肌肥大的跨膜信号传导机制中的作用。发现,胶原、纤维连接蛋白、层粘连素明显有助于培养心肌细胞的贴壁、伸展。牵张刺激后,胶原、纤维连接蛋白基质组心肌细胞的＾３Ｈ－亮氨酸掺入率和心肌细胞表面积均显著大于对照组,而层粘连素组无显著变化;可溶性纤维连接蛋白、ＲＧＤ肽均可显著抑制牵张刺     

人胚心肌细胞培养的初步研究(简报)

本室在乳鼠心肌细胞培养的基础上,最近又成功地培养了人胚心肌细胞。现报告如下。材料和方法妊娠17及18周的胎儿,经水囊引产娩出后,立即在无菌条件下取出心室肌,剪碎,以0.06％胰蛋白酶分次消化成单细胞,用含20％小牛血清的Eagle培养基(MEM)制成10~6细胞/毫升的心肌细胞悬液,进行原代人胚心肌细胞单层培养。在倒置显微镜下观察心肌细胞的搏动及形态,拍摄照片,以及录制心肌细胞搏动的电视录像,并作扫描也子显微镜的观察。     

密度梯度离心法同时分离新生大鼠原代心肌细胞与成纤维细胞

本文旨在探讨一种改良的同时分离新生大鼠原代心肌细胞和成纤维细胞的方法,以建立良好的原代心肌细胞及成纤维细胞研究模型。无菌状态下取Wistar乳鼠(出生不超过2天)心室,用II型胶原酶消化,控制消化时间及次数、搅拌速度、离心次数和速度等,结合Percoll密度梯度离心法分离心肌细胞及成纤维细胞,进行体外培养,观察细胞形态,继而用0.2%台盼蓝染色检测细胞存活率,免疫荧光染色法检测心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,c Tn I)、波形蛋白(Vimentin)及α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达,分别用于鉴定心肌细胞和成纤维细胞纯度。结果显示,本方法5次分离的心肌细胞平均存活率达92%,纯度达95%以上,细胞生长状态良好,可见贴壁自发搏动;成纤维细胞平均存活率达96%,纯度达94%。本方法能同时获得新生大鼠原代心肌细胞和成纤维细胞,具有很高的产量、存活率及纯度,且操作简便,耗时短,重复性好,是一种较为理想的原代细胞分离、培养方法,可满足各种后续实验要求。     

靶向PUMA的siRNA对缺氧/复氧诱导大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

为探讨p53上调凋亡调制物(p53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)在大鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenatio,H/R)损伤中的作用,本研究将靶向PUMA的siRNA(si-PUMA)转染大鼠心肌细胞以建立PUMA沉默表达模型,观察其对心肌细胞H/R损伤的影响.RT-PCR和Western印迹结果表明,最适转染浓度50 nmol/L si-PUMA能靶向抑制H/R损伤心肌细胞的PUMA表达;MTT法检测心肌细胞存活率及培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性测定结果发现,si-PUMA组细胞存活率较H/R 6 h模型组明显提高,培养液中LDH活性显著降低(P<0.01);分光光度法及Annexin V-FITC/PI联合染色流式细胞凋亡检测结果显示,si-PUMA组caspase-3活性较H/R 6h组明显下调,细胞凋亡率明显降低(P<0.01);RT-PCR结果提示,与H/R6 h组相比,si-PUMA组Bax及Bcl-2表达分别出现显著下调及上调(P<0.05).以上结果表明,靶向PUMA的siRN...     

培养新生大鼠心肌细胞的电信号传导：多电极记录研究

利用多电极阵列同步记录技术对培养的新生大鼠单层心肌细胞的电活动进行胞外记录,观察心肌细胞在自发搏动和电刺激情况下信号在细胞间的传导模式。通过对记录信号的处理和分析,能获得诸如起搏细胞的数量和位置、动作电位的传导速度和途径以及不同起搏细胞间的相互影响等信息。研究还发现,心肌细胞阈下刺激会影响细胞的搏动和信号传导。     

NGFI-B在应激损伤心肌细胞中的亚细胞定位及其生物学效应

目的:观察应激条件下心肌细胞中神经生长诱导蛋白质-B(NGFI-B)的表达和亚细胞定位的变化,为揭示应激机体心肌损伤的病理学机理提供科学依据.方法:建立心肌细胞应激损伤的离体细胞模型;采用Western blot 方法和细胞免疫荧光法观察NGFI-B在应激心肌细胞中的亚细胞定位;采用流式细胞术观察离体心肌细胞的凋亡率;...     

心肌微环境对诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的影响

目的:探讨体外心肌微环境对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为心肌样细胞的诱导作用。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)和心肌细胞并在体外培养纯化。以2×10~4/mL的细胞密度种植心肌细胞,培养72h后收集上清,在BMSCs的培养基内加入心肌细胞培养上清诱导BMSCs分化为心肌样细胞,实验共分6组:10%、20%、30%、40%及50%心肌细胞培养上清组及含10%胎牛血清的对照组,均诱导BMSCs7d,每天在倒置显微镜下观察细胞的形态变化;应用免疫细胞化学技术检测不同浓度心肌细胞培养上清组诱导7d后BMSCs中a-平滑肌肌动蛋白(a-sMA)、β-肌动蛋白(β-actin)、心肌特异性肌钙蛋白T(Troponin-T)、CD31以及FactorⅧ的表达。结果:心肌细胞培养上清组诱导BMSCs7d后,细胞的形态没有改变。10%、20%、30%、40%及50%心肌细胞培养上清组a-sMA、。-actin以及Troponin-T的表达均呈阳性,以30%心肌细胞培养上清组的蛋白表达量最高(P<0.01),而CD31和FactorⅧ的表达呈阴性。结论:心肌细胞的培养上清能够诱导BMSCs分化为心肌样细胞,且30%心肌细胞培养上清是诱导BMSCs向心肌样细胞分化的最适浓度。     

小鼠睾丸支持细胞的生物学特性研究

目的:获得高纯度的小鼠支持细胞,用以研究睾丸支持细胞在诱导胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中的作用,同时借助睾丸支持细胞减少进行体内诱导试验时可能产生的免疫排斥反应。方法:用胶原酶和胰蛋白酶组合消化结合选择性贴壁法从1周龄昆明白小鼠睾丸分离获得睾丸支持细胞,纯化后进行体外培养,观察其体外培养的生物学特性。结果:睾丸支持细胞体外培养3～4h即贴壁,贴壁后伸出3～4个突起,为成纤维型细胞,在体外培养2～3d即长满全瓶。油红Ο染色显示,其胞质含有大量脂滴。透射电镜观察结果表明,支持细胞核仁周围有卫星核小体。RT-PCR结果显示获得的细胞表达缪勒管抑制物,不表达促黄体素受体和小鼠VASA同源物。结论:获得了较高纯度的小鼠睾丸支持细胞,可以用于诱导小鼠胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的体内和体外试验。     

蛋白激酶Cδ可能参与肥大心肌细胞转向凋亡

为了探讨肥大心肌细胞对凋亡刺激的易感性及蛋白激酶Cδ(protein kinase Cδ,PKCδ)在其中的作用,以内皮素-1 (endothelin-1,ET-1)处理原代培养的新生大鼠心肌细胞,诱导心肌细胞肥大;再用血管紧张素Ⅱ(angiotensin II,Ang II)作为细胞凋亡诱导因子,采用鬼笔环肽(phalloidin)荧光染色与细胞面积测量两种方法检测心肌肥大,Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡。结果显示：(1)1与10 nmol/L ET-1作用48h,心肌细胞肌原纤维排列整齐、染色增浓,随ET-1浓度增加而愈加明显,心肌细胞表面积分别增加42．5%和67．3%,以此作为轻度和中度心肌细胞肥大模型。(2)正常、轻度肥大与中度肥大心肌细胞受1nmol/L AngⅡ处理24h后,凋亡率分别为(15．54±1．32)%、(20．65±1．40)%与(29．33±3．52)%,三组之间有显著差异(P＜0．05)。(3)受AngⅡ刺激后,PKCδ特异性抑制剂rottlerin不影响正常心肌细胞的凋亡率,却有效抑制了轻度和中度肥大心肌细胞的凋亡。肥大心肌细胞凋亡易感性明显高于正常心肌细胞,抑制PKCδ可以抑制肥大心肌细胞凋亡,提示PKCδ参与肥大心肌细胞凋亡过程。