以琥珀酸为唯一碳源选育ε-聚赖氨酸高产菌

本文旨在通过诱变和耐受性筛选的手段提高放线茵￡一PL的产量。以稠李链霉菌Strepto—myces padanus LS-L5为出发菌,经紫外诱变,在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上筛选快速生长的菌株,测定突变株的ε-PL发酵水平和遗传稳定性。经初筛和复筛,获得突变株H3,其摇瓶发酵ε-PL产量为0．68dL,较出发菌提高了41％,传代4次产量基本稳定。H3在5L发酵罐中分批发酵,ε-PL产量达到2．0g／L,较出发菌提高了一倍。在固定二氧化碳的能力方面,突变株H3的PEP羧化酶酶活较出发菌株LS-L5的PEP羧化酶酶活提高了1．67倍。     

ε-聚赖氨酸高产菌选育与发酵性能评价

【目的】选育ε-聚赖氨酸(ε-PL)高产菌,并探究不同碳源对其发酵性能的影响。【方法】借助基因组重排和核糖体工程两种育种手段强化ε-PL产生菌的合成能力,并利用p H冲击工艺评价不同碳源对ε-PL发酵的影响。【结果】经过4轮基因组重排和4轮核糖体工程连续选育,获得1株高产突变株Streptomyces albulus GS114,其摇瓶ε-PL产量达到3.0 g/L,较出发菌提高了1.7倍。该改造菌株在5 L发酵罐中分别以葡萄糖和甘油为碳源进行192 h的补料-分批发酵时,ε-PL发酵产量分别达到了43.4 g/L和45.7 g/L,较出发菌提高了11.0%和14.9%,而菌体量分别减少了24.0%和33.2%,ε-PL得率提高了34.2%和30.7%。【结论】基因组重排结合核糖体工程育种是一种有效的ε-PL高产菌选育手段,研究结果将为ε-PL高产菌改造和工业生产碳源选择提供直接指导。     

积累L-苹果酸的米根霉突变株酶活性初探

对富马酸产生菌株—米根霉ME-F10进行诱变育种的过程中, 得到一株性能稳定的高效积累L-苹果酸的突变株ME-M15。该菌株发酵96 h平均L-苹果酸产量达16.3 g/L, 较出发菌株L-苹果酸积累量平均提高3倍, 而富马酸和乙醇的积累量大幅下降。对突变株代谢途径关键酶活研究表明, 突变株富马酸酶胞质途径同功酶和乙醇脱氢酶活力较之出发菌株酶活力明显减弱, 而丙酮酸羧化酶活力无明显差别。     

ε-聚赖氨酸高产菌株选育及分批发酵的研究

以北里孢菌(Kitasatospora sp.)PL6-3为出发菌株,经硫酸二乙酯诱变,获得遗传性能稳定的AECr突变株MY5-36。MY5-36摇瓶发酵产ε-聚赖氨酸达1.17 g/L,是出发株PL6-3的3倍;5 L发酵罐批式发酵产酸达7.72 g/L,较出发菌株提高了7倍以上。与PL6-3相比,MY5-36菌株形态发生了很大变化,菌丝和孢子颜色都发生了改变。     

产紫杉醇菌株原生质体诱变育种的研究

对紫杉醇产生菌NCEU-1的原生质体进行了紫外线和氯化锂复合诱变,筛选制霉菌素抗性突变株,共筛选出了4株正突变株。经发酵筛选试验,获得了一株遗传性状稳定、高产紫杉醇的原生质体诱变菌株——UL_04-5,其紫杉醇产量从出发菌株的314.07μg/L提高至418.24μg/L。     

基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸放线杆菌

以琥珀酸产生菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593为出发菌,分别经过紫外线-甲基磺酸乙酯(UV-EMS)和紫外线-硫酸二乙酯(UV-DES)诱变处理,得到7株耐酸性有所提高的突变株.以此作为候选菌库,经3轮原生质体递进融合,筛选获得4株可以在pH 5.6下生长的改组菌株.其中改组菌株F3-21在pH 5.6的完全液体培养基中生长的OD值是原始菌的7倍,在pH 5.2条件下仍能生长;其摇瓶发酵48h琥珀酸产量较原始菌株提高48%.在5L发酵罐中进行分批发酵,当控制pH在较低值(5.6～6.0)时,F3-21厌氧发酵48h积累琥珀酸38.1g/L,较出发菌株提高了45%;当控制pH在6.5～7.0时,F3-21厌氧发酵32h积累琥珀酸40.7g/L.F3-21在5L发酵罐中进行补料分批发酵,厌氧发酵72h,产琥珀酸达67.4g/L.结果说明基因组改组技术能够改进琥珀酸放线菌的耐酸性能及其琥珀酸的产量.     

新一代糖化酶高产菌株的选育及其工业应用

【目的】建立对糖化酶生产菌种黑曲霉随机突变文库进行筛选的方法,以获得糖化酶酶活提高的突变菌株。【方法】以一株可产糖化酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger X1为出发菌株,经硫酸二乙酯诱变获得突变文库,采用葡萄糖的结构类似物——2-脱氧葡萄糖进行筛选,并在筛选过程中逐渐提高2-脱氧葡萄糖浓度,定向选育具有2-脱氧葡萄糖抗性、高产糖化酶的突变株。【结果】获得的高产突变菌株DG36摇瓶发酵糖化酶产量比出发菌株A.niger X1提高22.2%–33.8%,经工业水平50 m~3罐发酵测试,突变株DG36发酵128 h糖化酶活可达49094 U/m L,在相同发酵时间内,其酶活较出发菌株A.niger X1提高32.8%,发酵时间缩短16.9%。【结论】本研究开发了一种以2-脱氧葡萄糖为抗性标记选育高产糖化酶突变株的方法,所得突变株DG36遗传性状稳定,与出发菌相比具有菌丝粗壮、产酶期提前、糖化酶活高、发酵时间短、有利于发酵后处理的优点。     

重离子诱变技术选育碱性蛋白酶高产菌株

从采集的土壤样品中分离筛选出一株碱性蛋白酶产生菌G-41,经16S rRNA分子鉴定为芽孢杆菌属菌株。该菌株在发酵培养基中能产生较高产量的胞外碱性蛋白酶(1.7×104U/mL)。以G-41为出发菌株,对其进行重离子辐照诱变处理,获得突变株G-41-68,将该突变株再次经重离子诱变,从大量突变株中筛选出碱性蛋白酶高产菌株15Gy-54,其酶活力达到6.22×104U/mL。与出发菌株相比较,突变株G-41-68和15Gy-54的酶活力分别提高了1.58倍和2.65倍。对突变株15Gy-54的发酵条件进行了优化研究,结果表明,该菌株的碱性蛋白酶活力得到进一步提高,达到7.18×104U/mL,其最适发酵条件为:培养基(g/100mL)为胰蛋白胨1、酵母膏0.5、乳糖5、Na2HPO4·12H2O0.4、KH2PO40.03、Na2CO30.1、MgSO40.0481(4×10-3mol/L)、pH8.0,培养温度41℃,振荡培养时间42-48h。实验结果表明,重离子辐照诱变技术是一种非常有效的微生物诱变育种新技术。     

豆豉纤溶酶产生菌的筛选及诱变

从广泛收集的豆豉成品及半成品中筛选到数株菌落形态各异且具有纤溶酶活性的菌株.分别采用亚硝酸和紫外线对豆豉纤溶酶产生菌DC-12进行诱变育种,成功筛选到了3株突变株,其纤溶酶产量较出发菌株分别提高了3.6、3.7和4.75倍.     

阿维菌素高产菌株的选育Ⅰ

目的：全面了解阿维菌产生菌S.avermitilis的生长特性并获得阿维菌素的高产菌株。方法：以S.avermitilis Y20为出发菌株,考察该菌株的菌落特征和发酵特性,分别利用紫外线（UV）、亚硝酸（HNO3）及亚硝基胍（NTG）并结合L－异亮氨酸（L－Ⅱe）诱导等手段对出发菌株Y20进行诱变处理。结果：获得高产阿维菌素变异株H336,发酵单位达到852μg/ml。结论：与出发菌株相比,突变株阿维菌素的产量稳定,发酵单位提高了10倍以上。     

Throughput screening of a high succinic acid-producing strain

以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes F3-21为出发菌株,分别用吖啶黄、紫外线、紫外线-硫酸二乙酯和亚硝基胍进行诱变,产生突变菌库.用“96孔板培养-HPLC浓缩检测.厌氧瓶复筛”的模式筛选高产突变株.从1056株突变株中,筛选到一株高产菌株Ⅵ-10-C.连续传代10次,产酸水平不变.在5L发酵罐中补料分批发酵72 h,Ⅵ-10-C产琥珀酸87.6 g/L,生产强度1.22 g/(L·h),糖酸转化率0.66 g/g;琥珀酸产量比出发菌提高了30％.代谢通量与关键酶活性分析表明:相比于F3-21,Ⅵ-10-C发酵过程中从磷酸烯醇式丙酮酸节点处流向草酰乙酸的代谢流量增加了28.9％,相对应的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)酶活提高了23.5％.结果表明用“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的模式能快速有效筛选高产琥珀酸菌株.     

真空微波诱变结合化学诱变选育酸性纤维素酶高产菌株

以酸性纤维素酶产生菌绿色木霉（Trichoderma viride）WL0512作为原始出发菌株,首先经自然分离筛选出一株产酶较稳定的菌株TVN-18,其羧甲基纤维素酶活（CMC酶活）达2765．8U／g,滤纸酶活（FPA酶活）达48．5U／g。再经真空微波和甲基磺酸乙酯（EMS）逐级诱变处理,获得了一株高产、稳产酸性纤维素酶的E6—1菌株,其CMC酶活达4396．6U／g,FPA酶活达126．0U／g,分别是菌株TVN-18的1．59倍和2．60倍。通过对固态发酵培养基麸皮和稻草比例、料水比以及初始pH值的优化,突变株的产酶能力进一步得到提高,其产的CIVIC酶活和FPA酶活分别提高了22．3％和22．4％。     

解脂耶氏酵母诱变育种及发酵产α-酮戊二酸条件优化

对具有发酵产α-酮戊二酸能力的解脂耶氏酵母(Yarrowia Lipolytica)ZY-4进行了紫外诱变和NTG诱变育种,筛选得到产量提高的突变株,并对突变株的发酵培养基进行了优化,结果表明,紫外诱变和NTG诱变后筛选到的突变株分别比原始出发菌株产量提高了67.8%和110%。优化后发酵培养基成分为甘油8%,氯化铵5.0 g/L,硫胺素1.0μg/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,七水硫酸镁0.5 g/L,培养基优化后α-酮戊二酸产量比原始出发菌株提高了232.4%。     

琥珀酸放线杆菌的耐高浓度钠离子菌株选育

以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593为出发菌,经过紫外线和甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理,选育出一株耐高浓度钠离子菌株SE-6.该菌株在5 L发酵罐中进行分批发酵,单独使用Na2CO3控制发酵过程pH,发酵48 h琥珀酸产量达到35.8g/L,较出发菌(26.0 g/L)提高了37.7%;若采用MgCO3和Na2CO3共同调控发酵过程pH,发酵48 h琥珀酸产量达到45.0 g/L,较出发菌(37.4g/L)提高了20.4%.     

绿色木霉原生质体诱变筛选纤维素酶高产菌株

以绿色木霉F264为出发菌株制备其原生质体,对其进行紫外线诱变处理,筛选出一株纤维素酶高产突变株绿色木霉F-UV264,其滤纸酶活由出发菌株的5.2IU/g干料提高到15.78IU/g干料,产酶能力提高了3倍。经过10代PDA斜面继代培养及发酵试验,表明该菌株是比原菌株更优秀的稳定高产株。     

产纤维素酶菌株的筛选及离子束诱变

从含腐败秸秆的土壤中分离出刚果红水解圈与菌落比值(D/H)较大的7株纤维素酶产生菌,其中菌株S-1分解羧甲基纤维素钠的酶活(CMC酶活)最高,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌。以之为出发菌株进行离子束诱变,采用酶标仪高通量酶活测定法筛选出CMC酶活较高的突变菌株进行传代培养,测定其传5代后菌株的CMC酶活,得到15株CMC酶活较高的突变菌株,其中突变菌株308的菌落形态变化较大,其CMC酶活最高,接种24 h后比出发菌S-1提高了84.4%,且突变菌株308的CMC酶活的提高具有遗传稳定性。表明离子束诱变对于提高菌株产纤维素酶能力具有潜在的应用价值。     

ε-聚赖氨酸高产改造菌发酵过程分析与工艺改进

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是我国新近批准的一种天然食品防腐剂,由链霉菌好氧发酵制备而来。通过传统育种手段强化产生菌ε-PL合成能力是提高其发酵水平的重要途径,然而高产改造菌与出发菌株发生的生理改变却很少被关注。本研究从培养特征,营养需求和发酵过程参数等方面进行比较与分析,发现高产菌株Streptomyces albulus GS114具有需氧量小、菌体量低、ε-PL产量高、单位菌体ε-PL合成能力强、转化率高等特点。为了进一步提高S.albulus GS114的ε-PL产量,通过提高pH冲击策略中预培养p H增加其菌体量,实现ε-PL产量达到53.49 g/L,较优化前提高了11.9%。研究结果将为ε-PL工业化生产奠定基础。     

链霉菌ε-聚赖氨酸发酵过程中的氧化胁迫效应

【目的】探究ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌对p H和ε-PL的耐受性、氧化胁迫与ε-PL合成之间的关系。【方法】选取3株ε-PL产生菌Streptomyces sp.AF3-44、Streptomyces sp.AS32和Streptomyces albulus F15,比较其在发酵性能、p H和ε-PL耐受性以及抗氧化胁迫能力上的差异,并对菌株发酵过程的活性氧成因进行分析。【结果】在3株菌中AF3-44具有最强的p H和ε-PL耐受性及抗氧化胁迫能力,因而在发酵后期能够保持良好的细胞活性和最高的ε-PL浓度;ε-PL引起的氧化胁迫主要发生在发酵前期,而发酵中后期氧化胁迫的产生主要由酸性p H导致。【结论】提高链霉菌ε-PL发酵过程中的抗氧化胁迫能力,可提升菌体活力和发酵水平。     

紫外、~(60)Co复合诱变选育烟色烟管菌漆酶高产突变株

对烟色烟管菌(Bjerkandera fumosa 5.0172)的孢子悬浮液进行紫外诱变筛选得到一株诱变株ZW-7,其产漆酶的活力是原始菌株的1.33倍,继代培养5代后,未见酶活下降。将诱变株ZW-7的孢子悬浮液用60Co-γ射线进行辐射诱变筛选得到一株诱变株Co-11,其产漆酶的活力是ZW-7的1.18倍,为380.5 U/L,较原始菌株的250.6 U/L提高了约58.1%,继代培养5代后,酶活稳定。     

耐铵型产琥珀酸放线杆菌的选育

以Actinobacillus succinogenes NJ113为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)诱变,在含8～20 g/L硫酸铵平板中筛选到一株耐铵型突变株YZ25,该菌株在含8 g/L硫酸铵培养基中厌氧发酵,琥珀酸产量达32.68 g/L,比出发菌提高了180.5%,对葡萄糖收率达65.4%,副产物乙酸、甲酸产量分别下降3.5%、28.7%,琥珀酸/乙酸比值由0.63提高到2.5。在7.5 L发酵罐中,用氨水调节pH分批实验,发酵34 h琥珀酸产量达27.13 g/L,较出发菌株提高了85.3%。