副溶血性弧菌生物被膜形成及其调控机制研究进展

副溶血性弧菌是一种广泛存在于海产品中并可引起人类急性肠胃炎的食源性致病菌。该菌形成的生物被膜能够增强体外环境中的存活率,促进对宿主的定殖和感染,还会导致被污染的加工设备与食物之间发生交叉感染。深入了解生物被膜形成背后的调控机制,有助于制定有针对性的策略,干扰其适应环境变化的过程,从而降低副溶血性弧菌对人类的危害。本文主要综述了鞭毛、菌毛和胞外的多糖等基质组分在生物被膜形成中的作用以及c-di-GMP和群体感应对生物被膜形成的调控。     

副溶血性弧菌-霍乱弧菌混合生物被膜形成过程研究

【目的】研究副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)和霍乱弧菌(Vibriocholera,VC)混合生物被膜的形成过程。【方法】在4、8、12、24、36、48、60、72 h测定单独条件下VP、VC及其混合后生物被膜的形成情况,通过结晶紫染色法、平板菌落计数法、测定胞外多糖、胞外蛋白,通过荧光原位杂交(FISH)观察混合生物被膜形成。【结果】虽然形成的混合生物被膜量介于VC和VP之间,但混合生物被膜在形成过程中,成熟期后生物被膜量的变化较小,对环境的抗性增强。混合生物被膜中拥有更多的活菌,混合生物被膜形成过程中胞外蛋白和胞外多糖的变化体现出其可能在对抵御不适应环境中起重要作用,通过FISH可观察到不同时期生物被膜的变化过程。【结论】VC与VP共同形成生物被膜的过程中,混合生物被膜总量虽然减少,但混合生物被膜中拥有更多的活菌,这可能引起更大的危害。研究混合生物被膜形成过程中被膜的变化,可为有害生物被膜的控制提供基础。     

冷激条件下预形成副溶血性弧菌生物被膜的发展变化

【目的】生物被膜可附着在食品或医药生物材料表面引起持续性的感染,而现今极少有关于温度变化对预形成生物被膜影响的研究。本文分析了冷激条件下副溶血性弧菌预形成生物被膜的发展变化。【方法】以改进的结晶紫染色法检测生物被膜总量,以改进的超声法和Lowry法量化胞外多糖和蛋白质,以RNA试剂盒提取并纯化生物被膜形成的相关基因。同时,激光共聚焦扫描显微镜直观显示了冷激条件下预形成生物被膜形态结构的变化,并深入分析了生物被膜结构的变化,以及生物被膜结构参数和基因转录的相关性。【结果】在冷激条件下,副溶血性弧菌生物被膜总量增加,同时,副溶血性弧菌预形成的生物被膜胞外多聚物的主要成分胞外多糖和蛋白质也逐渐增加,被膜形成相关鞭毛基因和毒力基因的转录活跃。生物被膜的平均厚度(MT)、平均扩散距离(ADD)、孔隙率(P)、生物被膜粗糙度(BR)和均匀性(H)在冷激过程中也发生了变化,同时这些参数之间存在显著相关性(P<0.01),而生物被膜结构参数与生物被膜相关基因转录的相关性较弱(P<0.05)。【结论】因此,4°C和10°C冷激不能完全抑制副溶血性弧菌预形成生物被膜的生长,风险评估人员在制定控制食源性感染风险的战略时应考虑到这一因素。     

肽酶PepT参与副溶血弧菌的浮游运动和生物被膜形成

pepT基因编码一种金属依赖性肽酶T (peptidase T,PepT),能特异性催化三肽N端氨基酸,因此也称为氨肽酶T。研究发现大多数氨肽酶参与细菌蛋白质新陈代谢和调节三肽活性,但关于PepT在细菌毒力及致病性方面的报道较少。[目的]本文选取PepT为研究对象,研究其对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法]通过构建缺失株ΔpepT和回补株CΔpepT,比较菌株在运动性、生物被膜、环境耐受、细胞毒性等方面的差异。[结果]与野生株相比,ΔpepT缺失株的极性鞭毛转录水平极显著下降,浮游运动能力降低;同时生物被膜形成能力减弱,而细菌群集运动及环境耐受能力无显著差异。此外,缺失pepT基因会导致副溶血弧菌的细胞毒性和小鼠毒力作用显著下降。[结论]pepT基因与副溶血弧菌浮游运动和生物被膜形成能力相关,并且影响其致病性。     

基于高通量共聚焦激光扫描显微镜方法定量分析副溶血性弧菌生物被膜结构

【目的】副溶血性弧菌是水产品中常见的食源性致病菌,生物被膜的形成对副溶血性弧菌的环境生存和传播至关重要。这项工作的目的是评估临床和环境中分离出的44株副溶血性弧菌菌株形成的生物被膜的结构多样性。【方法】该研究基于共聚焦激光扫描显微镜的高通量方法,使用与高分辨率成像兼容的96孔微量滴定板,结合结构分析软件ISA-2来研究生物被膜形成和结构,分析22株食品与22株临床来源的副溶血性弧菌菌株形成的生物被膜结构参数(生物体积、平均厚度、粗糙系数)。【结果】CLSM图像显示,44株副溶血性弧菌菌株在培养48h后能够形成3D结构,进一步比较分析了临床来源菌株与环境来源菌株形成的生物被膜结构异同,发现临床菌株生物被膜的变异系数比环境菌株生物被膜的变异系数小,且同时携带tdh和trh两种毒力因子的菌株生物被膜变异性最小。凝聚层次聚类分析结果显示,副溶血性弧菌生物被膜可以分为致密且表面光滑(39%)、斑驳且表面粗糙(27%)、疏松且表面坑洼(34%),临床菌株易形成致密且表面光滑和斑驳且表面粗糙的生物被膜,而环境菌株易形成致密且表面光滑和疏松且表面坑洼的生物被膜。【结论】该研究深入了解了副溶血性弧菌生物...     

组氨酸氨解酶HutH对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响

组氨酸氨解酶(HutH)作为组氨酸代谢通路上的第一个代谢酶,控制细菌内部组氨酸的代谢。HutH在多数细菌中高度保守,参与细菌的能量代谢平衡。【目的】选取HutH作为研究对象,探究其对副溶血弧菌生物学特性以及致病性的影响。【方法】利用同源重组的方法构建缺失株ΔhutH和回补株CΔhutH。研究HutH对副溶血弧菌生长特性、组氨酸利用能力、组氨酸代谢相关基因表达水平、运动性、生物被膜、环境耐受、细胞毒性以及对小鼠毒力的影响。【结果】与野生型菌株相比,hutH基因缺失不影响副溶血弧菌的生长特性、耐酸耐碱能力、耐盐能力和群集运动。但ΔhutH在组氨酸作为唯一碳源的M9极限培养基中生长受到显著抑制。另外,我们证实,hutH基因缺失使组氨酸代谢操纵子内的相关基因转录水平显著下降,基因VP0889的表达水平提高。hutH基因缺失导致副溶血弧菌生物被膜形成能力下降、泳动能力下降、对HeLa细胞的毒性降低、对ICR小鼠的致死率显著降低。【结论】本研究表明,hutH基因缺失影响副溶血弧菌代谢组氨酸的能力,而且首次证实,HutH在副溶血弧菌的生物被膜形成、运动性和对小鼠毒力等方面具有重要作用,为从调控组氨酸...     

蓝莓提取物对副溶血性弧菌的抑制作用

本文以北高丛蓝莓中的栽培品种埃利奥特为原料,通过L16(43)正交实验,分析比较了16种提取物对副溶血性弧菌的抑菌效果及各提取物的pH值.结果表明:在30℃下,以65％乙醇(w/w)为溶剂,超声提取25min为最优提取条件.采用此条件得到的提取物具有最低的pH值,在浓度为100和40 mg/mL时,对副溶血性弧菌的抑菌率分别达100％和81.3％.     

牛蒡提取液对副溶血性弧菌的抑制作用

研究了牛蒡提取物对副溶血性弧菌的抑制作用。采用80%乙醇分别浸提两个牛蒡品种柳川理想及黄肌牛蒡根的皮及去皮根,四种提取物分别命名为LP、LR、HP和HR。采用滤纸片扩散和最低抑菌浓度法筛选了四种提取物的抑菌效果,时变抑菌研究了常温(25℃)和低温(4℃)下牛蒡提取物在无菌蒸馏水(DW)以及脑心浸汤(BHI)中对副溶血性弧菌的抑制效果。结果显示,四种提取物中LP的抑菌活性最好;经1000μL/mL LP提取液7小时处理,在4℃和25℃DW环境均未有副溶血性弧菌检出;经各浓度提取液1天处理,在4℃和25℃BHI环境均未有副溶血性弧菌检出。LP对副溶血性弧菌弧菌具有良好的抑制作用。     

外膜蛋白OmpR对副溶血弧菌致病特性的影响

[目的]探究OmpR在副溶血弧菌生物学特性和致病性中发挥的作用。[方法]利用同源重组技术构建了副溶血弧菌ompR基因缺失株(ΔompR)和互补株(CΔompR),分析各菌株的生长特性、运动性和生物被膜形成能力的差异;比较各菌株对细胞黏附、细胞毒性和小鼠致病性的影响。[结果]ompR基因缺失对副溶血弧菌的生长特性、运动性以及细胞毒性无显著影响。但与野生株相比,ΔompR的生物被膜的形成能力显著降低;感染ΔompR的小鼠存活率升高了25%,病变程度更低;ΔompR在小鼠心脏、肝脏和肾脏中的载菌量显著低于野生株,互补株毒力基本恢复至野生株水平。[结论]OmpR参与副溶血弧菌生物被膜形成和致病过程,是副溶血弧菌潜在的毒力因子。     

试用噬菌体对副溶血弧菌分型研究

应用噬菌体分型是在疾病发生流行时追索传染源和传播途径等流行病学调查中的一种有效手段。该文作者采用自行分离的8株副溶血弧菌噬菌体对实验室保存的214株副溶血弧菌试做了分型研究,结果分型率为89．72％,检出36个不同的噬菌体型,其中以400（1963％）、100（9．35％）、300（7％）、010（6．54％）、440（6．07）、220（4．76％）和200（4．21％）等7个型较常见,占总分型菌的57．480％但从本次试验结果表明福建地区的副溶血弧菌的噬菌体型分布较复杂,型别多且分散,可能与本次的供试     

生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的基因转录谱分析

【目的】探究生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的差异基因表达情况,为今后研究生物膜形成调控机制提供基因信息。【方法】以非生物膜形成条件下为参照,采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）研究,分析生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的基因表达情况,并采用实时定量PCR （quantitative real-time PCR,qPCR）进行验证。【结果】本研究共获得979个差异显著性表达基因（differentially expressed gene,DEG）,其中下调基因379个,上调基因600个。基因本体（gene ontology,GO）分类分析结果显示,共有363个DEGs注释到分子功能、细胞组分和生物学过程3个一级分类和30个二级分类;京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）代谢途径分析结果显示,共有706个DEGs归到37个代谢通路中（Q value<0.05）,差异表达基因主要集中在细胞代谢和转运通路上;蛋白相邻类的聚簇（clusters of orthologous groups,COG）分类结果显示,有888个DEGs可归为20个类别,涉及DEGs最多的为氨基酸转运与代谢、一般功能预测基因、能量产生与转换以及未知功能基因。qPCR验证挑选的DEGs变化趋势均与RNA-seq的结果一致。此外,从转录组数据中共筛选出10个c-di-GMP代谢相关基因、1个侧生鞭毛蛋白基因（lafA）、13个极生鞭毛合成相关基因、6个荚膜多糖合成相关基因、6个胞外多糖合成相关基因、5个IV型菌毛合成相关基因、膜融合蛋白（membrane fusion protein,Mfp）基因（cpsQ-mfpABC）、14个III型分泌系统1（T3SS1）相关基因、14个Vp-PAI基因（1个tdh2和13个T3SS2基因）、3个VI型分泌系统1（T6SS1）相关基因、6个T6SS2基因、45个推定调控子基因和15个推定的外膜蛋白基因。【结论】生物膜形成引起副溶血弧菌基因表达谱发生明显变化,差异表达基因中包含生物膜形成相关基因、关键毒力基因和许多推定调控子基因等,这为后续研究生物膜形成调控机制提供重要信息。     

副溶血性弧菌CRISPR的检测及其结构分析

【目的】检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,简称VP)中规律成簇间隔的短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),并对不同来源的VP中CRISPR位点的结构多样性进行分析。【方法】根据CRISPR DB数据库中公布的VP中确定的CRISPR结构序列CRISPR-1及文献中新发现的疑似CRISPR结构序列CRISPR-2设计引物,对不同来源的79株VP进行PCR扩增。利用CRISPR Finder分析CRISPR结构,采用生物信息学方法对不同来源VP的CRISPR位点结构多样性进行比较分析。【结果】79株VP中CRISPR-1的检出率为92.41%,CRISPR-2的检出率为96.20%,同时具有这2个位点的菌株占总数的89.87%,只有1株菌被检出不含有任何位点。分别比较不同来源的菌株CRISPR-1、CRISPR-2位点的重复序列发现不存在序列差异,而临床菌株的这2个CRISPR位点在间隔序列上比环境分离菌株存在更多的变异。2个CRISPR位点根据间隔序列的不同在VP中一共组成8种CRISPR谱型(编号A-H),除F谱型外,A-E、G谱型均只在临床分离菌株中发现,而在环境分离菌中还发现不含任何位点的H型。【结论】CRISPR在VP中普遍存在。环境分离菌株与临床分离菌株中CRISPR的结构存在差异。     

ToxR负调控副溶血弧菌中c-di-GMP的合成

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是世界范围内引起海产品相关食物中毒的主要致病菌,具有很强的生物膜形成能力。ToxR是一种膜结合调控蛋白,对副溶血弧菌生物膜形成具有一定的调控作用,但具体机制尚未见报道。c-di-GMP是一种普遍存在于细菌中重要的第二信使,参与调控细菌的多种生物学行为包括生物膜的形成。本文探究ToxR对副溶血弧菌中c-di-GMP代谢的调控作用。利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中c-di-GMP水平的差异。挑选c-di-GMP代谢相关基因scrA、scrG和vpa0198为进一步研究的靶标,采用实时定量qPCR实验检测靶基因在WT和ΔtoxR中的转录水平差异;将靶基因调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒中无启动子的β半乳糖苷酶基因上游,采用lacZ报告基因融合实验进一步研究ToxR对靶基因的转录调控关系;将重组质粒分别导入含有pBAD33或pBAD33-toxR的EC100lpir中,采用lacZ报告基因融合实验研究ToxR是否能在异体宿主中调控靶基因的表达;PCR扩增靶基因上游调控区DNA序列,并纯化His-ToxR蛋白,用凝胶阻滞实验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究His-ToxR与靶基因启动子区DNA序列是否具有结合作用。ELISA结果显示ΔtoxR中c-di-GMP含量显著性高于WT中的,说明ToxR抑制c-di-GMP的产生;实时定量qPCR结果表明WT中scrA、scrG和vpa0198的转录水平显著性高于ΔtoxR中的,表明ToxR抑制它们的转录;lacZ报告基因融合实验结果表明ToxR可抑制副溶血弧菌和EC100lpir中scrA、scrG和vpa0198的启动子区活性;EMSA实验显示His-ToxR能特异性地结合到scrA和scrG的上游调控区DNA序列上,而对vpa0198的上游调控区DNA序列无结合作用。综上所述,ToxR通过直接调控相关酶蛋白基因的转录来抑制副溶血弧菌内c-di-GMP的合成,从而有助于精确调控生物膜形成等细菌行为。     

H-NS蛋白对副溶血弧菌hcp1的转录调控

【目的】研究调控子H-NS对副溶血弧菌T6SS1结构蛋白基因hcp1的转录调控机制。【方法】利用Western blot检测Hcp1蛋白在野生株(WT)和hns基因敲除株(Δhns)中表达水平的差异。提取WT和Δhns的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法验证H-NS对hcp1的转录调控关系。进而采用引物延伸实验研究hcp1的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对hcp1的调控关系。PCR扩增hcp1的整个启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证His-H-NS对hcp1启动子区是否具有直接的结合作用。【结果】Western blot和实时定量RT-PCR结果显示H-NS能抑制hcp1的表达;引物延伸结果显示hcp1只有一个转录起始位点T(–62)(翻译起始位点为+1),且其转录活性是H-NS和σ54依赖性的;EMSA实验表明H-NS对hcp1的启动子区具有直接的结合作用。【结论】H-NS能直接结合到hcp1启动子区而抑制其转录表达。