中华蜜蜂溶血肽基因在杆状病毒系统中的表达

构建含中华蜜蜂溶血肽基因的重组转移载体pBacHT-GFPTAccM,转化受体菌DH10Bac,得重组穿梭载体Bacmid-GFPTAccM, Lipofectin介导其基因组DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4。SDS-PAGE分析表明,感染重组杆状病毒Bacmid-GFPTAccM的细胞表达产物在约为34 kD处出现特异性条带,其表达量约占细胞总蛋白的3%。Western blotting和细胞表达时相动态分析证明中华蜜蜂溶血肽基因已在粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4中进行了成功的表达。     

Recombinant expression of Drosophila melanogaster α-L-fucosidase in Trichoplusia ni cells

A cDNA encoding an α-l-fucosidase from Drosophila melanogaster was obtained from the recombinant plasmid named pGEM-DmFuca and inserted into the pBacHTeGFPT vector to construct the recombinant donor plasmid which was transposed to the target AcBacmid in Escherichia coli (DH10) by Tn7 transposition function. The AcBacmid-GFP-DmFuca plasmid was used to transfect Tn-5B1-4 cells of the Cabbage looper Trichoplusia ni. SDS-PAGE analysis revealed a band of about 80 kDa. Using a polyclonal antiserum raised against α-l-fucosidase protein from D. melanogaster Western blotting analysis confirmed that the fusion protein eGFP-DmFuca has been successfully expressed in a biologically active form in Tn-5B1-4 cells. The recombinant protein, containing the histidine-tag motif, was purified using an affinity chromatography column. In vitro binding assays the purified eGFP-DmFuca interacts with α-l-fucose residues present on the micropyle of the D. melanogaster eggshell, confirming that the α-l-fucosidase is a good candidate as receptor involved in gamete interactions in fruit fly.     

重组人钙调素的制备及对细胞增殖作用影响的研究

The gene coding for human CaM was amplified by PCR in which pUC/hCaM3 cDNA was usd as template. After inserting the hCaM III cDNA into the expression plasmid pBV220, we constructed the hCaM3 cDNA-recombinant expression vector(hCaM3/pBV220). The recombinant plasmid was then transformed into E. coli DH5 alpha. After heat induction, a high level expression of CaM protein was obtained. SDS-PAGE analysis showed that the recombinant E. coli could express a 17 kD protein which accounted for about 20% of the total cellular protein. Western blot analysis showed that anti-CaM monoclonal antibody(McAb) specifically bound to the 17 kD band of expression product. rhCaM was purified by Phenyl-sepharose CL-4B affinity chromatography from recombinant bacterial lysate. 3-4 mg of the purified protein were obtained from 1 liter of bacterial culture. The rhCaM was able to activate NAD kinase to the same extent as the standard human brain CaM (Sigma). K562 cells and SP2/0 cells were seeded in 24-well or 96-well plate and cultured for 48 h with rhCaM and CaM-antagonist trifluoperazine(TFP). Cell proliferation rates was determined by MTT assay. There was a significant positive correlation between the concentrations of rhCaM and the cell proliferation rates. CaM-antagonist TFP had an inhibitory effect on cell proliferation rate. The inhibition could be corrected by the addition of extracellular rhCaM.     

纤维连接蛋白细胞结合区功能多肽在杆状病毒表达系统中的表达与纯化

目的：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纤维连接蛋白（FN）细胞结合区功能多肽（CBD）,并对其进行纯化和鉴定。方法：经PCR获得人血浆FN-CBD基因,酶切后定向克隆到T载体上,经测序正确后插入pFastBacHTB载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞;用抗生素平板筛选重组杆粒,脂质体介导重组杆粒转染sf9昆虫细胞并进行蛋白表达;经Ni-NTA层析柱对重组多肽进行纯化,对纯化的多肽行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果：得到融合6个组氨酸残基的FN-CBD,SDS-PAGE显示其相对分子质量约为36000,Western-blot表明该多肽能与FN的多克隆抗体结合。结论：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能成功表达出人血浆FN-CBD,且表达产物具有良好的免疫原性,为后续结构、功能研究奠定了基础。     

重组人钙网蛋白的克隆与原核表达

［摘要］目的: 克隆人钙网蛋白（calreticulin,CRT）并在E.coli中原核表达和纯化。方法：采用RT-PCR 法从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人钙网蛋白cDNA,构建CRT原核表达质粒（pET-15b/CRT）并转化E.coli 的Rossetta菌株。IPTG诱导后,表达蛋白在变性条件下经Ni-NTA 树脂亲和层析纯化,然后透析复性。分别用SDS-PAGE和Western blotting法鉴定CRT表达和纯化状态。结果：从A549细胞总RNA中成功获得人CRT cDNA克隆,重组质粒pET-15b/CRT构建正确。转化pET-15b/CRT的E.coli Rossetta诱导性表达重组人CRT蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功建立了CRT原核表达和纯化的实验方法,该方法为后续的CRT蛋白功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3369基因的表达和纯化

在大肠杆菌中高效表达结核分枝杆菌Rv3369蛋白,获得纯化的重组蛋白rRv3369。通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增Rv3369基因;以质粒pET28a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3);以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定rRv3369在大肠杆菌中的表达,确定rRv3369在大肠杆菌中的表达形式;采用Ni-NTA His.Bind Resin来纯化重组蛋白。重组质粒pET28a-Rv3369中目的基因测序结果与报道序列相同。分子量约19.5kDa,表达量约占菌体总蛋白的18%,纯化后的重组蛋白样品经SDS-PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为90%以上,每100mL培养菌可获得1.56mg左右的重组蛋白。用亲和层析法纯化的重组蛋白纯度较好。     

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的异源表达和应用

旨在研究大肠杆菌产磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)的发酵表达和分离纯化,探究PI-PLC酶切GPI锚定蛋白的效果。依据NCBI数据库中蜡样芽孢杆菌的PI-PLC的基因序列,按照大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化,合成相应基因序列并构建基因表达载体pGEX-6P-1-PI-PLC。将重组质粒转入受体菌E.coli BL21(DE3)中,通过加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因PI-PLC表达。经检测,含有GST标签的PI-PLC融合蛋白以可溶蛋白形式存在于菌体破碎上清,分子量约为61 kDa,与预期相符。初步优化诱导表达条件后,发现最佳诱导表达条件为:以接种量5%接种体积分数接种,待菌体生长至OD600nm达到0.5,在16℃条件下以0.3 mmol/L浓度IPTG诱导24 h。利用GST标签对蛋白进行纯化,纯化后的PI-PLC质量浓度为0.52 mg/mL,比酶活为1322.5 U/mg。利用PI-PLC酶液对哺乳动物细胞表面的模式GPI锚定蛋白CD59进行酶切,酶切作用显著。因此,下一步可以将PI-PLC融合蛋白应用于细胞生物学中对GPI-APs的研究和鉴定。     

意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

利用Bac to Bac系统将意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A₂（AmPLA₂）基因cDNA克隆至转移载体pFastBacHTa中,得到pBacHT-AmPLA₂,再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH10Bac中,通过转座作用,得到含AmPLA₂基因的重组病毒rBacmid-AmPLA₂的DNA。提取其基因组DNA,用脂质体介导转染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,得到重组病毒rACV-Bac-AmPLA₂。用此重组病毒感染Tn-5B1-4细胞, 在细胞中表达AmPLA₂。SDS-PAGE电泳结果显示,与6×His Tag融合表达的产物蛋白分子量约为18 kD左右,表达量约占细胞总蛋白的5.35%。Western blot印迹显示,融合表达产物能与意大利蜜蜂蜂毒AmPLA₂抗血清发生免疫反应。生物活性测定显示,含表达产物的细胞蛋白粗提物对底物蛋黄的酶活力约为6.13 μmol·min^-1·mg^-1。     

硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5的表达、纯化及酶学性质研究

经过PCR克隆得到硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5(3-OST-5)的基因,将其与大肠杆菌表达载体pET-15b连接后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,使用镍亲和层析柱纯化得到具有活性的3-OST-5。经测定纯化后的3-OST-5比活达到0.58 U/mg,是纯化前的5.27倍,回收率达80.4%。在此基础上,研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适温度为35℃,稳定范围为20-40℃;最适pH为7.0,在pH7.0-9.0范围内稳定。在反应液中加入终浓度为1 mmol/L的K+、Ca2+、Ba2+对酶促反应有一定的促进作用。     

家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的原核表达

通过Primer Premier 5.0设计1对特异性引物,用于扩增家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的部分DNA片段,对PCR扩增得到的DNA片段进行纯化,并对纯化后的双酶切DNA片段与经同样双酶切后的原核表达载体pET28a进行连接;对捕获有重组质粒pET28a-GP64的大肠埃希菌BL21（DE3）细胞进行IPTG诱导,通过SDS-PAGE对诱导产物进行电泳分析,结果表明扩增的目的片段获得了表达;通过His单抗对诱导产物进行Western Blot印迹分析,其结果表明诱导蛋白带为融合有组氨酸的目的蛋白。对原核表达的GP64截短蛋白和免疫佐剂进行充分研磨,将充分研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射,以制备的GP64多抗对家蚕核型多角体病毒粒子感染的BmN细胞总蛋白进行Western Blot印迹分析,结果在杂交膜上出现一条特异杂交带、其分子量大小约为64 ku,表明制备的GP64多抗可用于其功能的进一步研究。     

BALB/C鼠冷诱导RNA结合蛋白的原核表达、纯化及其单克隆抗体的制备

为了获得冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）的单克隆抗体,本通过RT-PCR 方法从冷处理BALB/C小鼠睾丸的总RNA中扩增获得CIRP基因序列,克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒pGEM-CIRP,并进行序列测定。将测序正确的CIRP序列插入质粒pQE-30-Xa,构建表达载体pQE-30-CIRP并转化E.coli M15,IPTG 诱导后SDS-PAGE分析表明CIRP基因在大肠杆菌中获得高效表达, 可溶性分析表明CIRP融合蛋白以包涵体形式表达。采用Ni-NTA亲和层析、电洗脱纯化融合蛋白CIRP,将纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠,三次免疫后,间接ELISA测定小鼠效价,效价为1:105,采用杂交瘤技术融合,用间接ELISA法、有限稀释法筛选阳性杂交瘤细胞,通过Western blot对McAb特异性进行鉴定,利用间接ELISA方法对McAb的Ig亚类(型)、杂交瘤细胞上清、腹水效价进行测定。结果获得了1A6、2D3、3C5及4C4 4株稳定分泌CIRP McAb的杂交瘤细胞株,1A6、3C5、4C4产生的单克隆抗体亚类均为IgG2b,2D3产生的单抗亚类为IgG3,轻链均属κ链。4株单克隆细胞上清效价均在1:103以上,腹水效价均达1:107以上。Western-blot分析4株单抗均能与重组蛋白CIRP特异性结合,与空载体对照没有反应。以3C5细胞株的腹水为一抗,检测冷应激小鼠多种组织中天然CIRP蛋白表达,结果显示3C5细胞腹水能识别心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸等多种组织中天然CIRP,并与能之与结合。这证明该抗体具有良好特异性和结合活性,制备的单克隆抗体可以用于深入开展CIRP的功能性和应用性研究。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

伪狂犬病毒gE基因在昆虫细胞中的高效表达

In order to develop a simple and safe test for the detection of vaccinated as well as wild type Pseudorabies virus (PRV) infected pigs, the modified gE gene of PRV Ea strain, obtained by cutting the 5' UTR using PCR and DNA recombinant technique, was inserted into baculovirus expression vector pFastBac 1, resulting the trans-position plamid pFE1.75. After homologous recombination, recombinant baculovirus rvBacE1.75 was gained and high level expression of glycoprotein E (gE) was observed after the infection of rvBacE1.75 to Tn-5B1-4 cells. The expression product was 80-88 kD and was specific to antisera against PRV Ea strain by Western-blotting. Purified recombinant proteins were used as an antigen in Latex Agglutination Test(gE-LAT) and the test was specific, sensitive, safe and simple.     

人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

人钙调素在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

利用基因重组技术,将经PCR扩增获得的人钙调素基因(hCaMcDNA)插入质粒pBV220,构建重组表达载体hCaM/pBV220,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆.阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDS-PAGE分析,可观察到一与CaM分子量相符(约17kD)的诱导表达条带,其表达量占菌体蛋白总量20%,并主要以可溶性形式表达.Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗人CaM单克隆抗体起特异反应.用Pheny1-SepharoseCL-4B疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物,每1L菌液可获CaM纯品3～4mg.重组人CaM(rhCaM)与牛脑CaM的氨基酸组成基本一致.生物活性测定结果提示,rhCaM具有激活NAD激酶的活性,其激活程度与标准人脑CaM几乎一致.     

人GST-14-3-3σ融合蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的:构建人14-3-3σ基因的原核表达载体,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化及活性检测。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增14-3-3σ基因编码序列,将其克隆到pGEX-KG载体中,重组质粒转化大肠杆菌Rossate后表达重组蛋白,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE和Western印迹检测融合蛋白的表达,采用GST pull-down技术检测已纯化的蛋白与已知体外相互作用蛋白AKT之间的相互作用。结果:从人乳腺文库中扩增获得约750 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序与目的基因序列完全一致;在Rossate菌株中诱导表达出相对分子质量约52 000的目的蛋白,SDS-PAGE和Western印迹结果表明融合蛋白表达成功,并纯化得到GST-14-3-3σ融合蛋白;通过GST pull-down技术检测证实GST-14-3-3σ融合蛋白可以和AKT在体外结合,并证实其具有生物学活性。结论:获得了原核表达的活性较好的GST-14-3-3σ蛋白,为后续研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。     

蛇毒纤溶酶原激活剂TSV—PA在昆虫细胞中的表达

将蛇毒TSV－PA基因插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBacHTa中,在粉纹夜蛾Tn-5B1-4细胞中进行表达。SDS－PAGE分析结果表明,表达产物为分子量33KD的TSV－PA蛋白。Western印迹分析证实了此结果,酶活力测定结果表明,昆明细胞表达的TSV－PA蛋白具有较高活性。     

长双歧杆菌NCC2705株果糖结合蛋白BL0033基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆长双歧杆菌NCC2705株果糖结合蛋白BL0033的基因,利用大肠杆菌表达GST-BL0033融合蛋白并纯化。方法：以长双歧杆菌NCC2705株基因组为模板,PCR扩增BL0033基因,并将其插入pGEX-4T-1表达载体,转化至大肠杆菌DH5α;提取质粒,经PCR、质粒双酶切及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21,并对表达条件进行摸索;用谷胱甘肽-Sepharose4B树脂对可溶性GST-BL0033融合蛋白进行纯化。结果：PCR扩增的BL0033基因长度接近1000bp,与预期值一致;重组菌在IPTG浓度为0.05mmoL/L的条件下,于16℃诱导过夜后,SDS-PAGE分析可见可溶性表达条带,相对分子质量约60×103,与预期值一致;亲和纯化后,SDS-PAGE结果显示单一的表达条带。结论：克隆了BL0033蛋白的基因,并表达纯化了融合蛋白GST-BL0033,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705株BL0033蛋白功能奠定了基础。