克隆猪技术及其在转基因猪研究中的应用

哺乳动物核移植技术是一种可以获得基因组遗传信息完全相同的后代的生物技术。猪体细胞核移植技术包括以下几个环节：卵母细胞的体外成熟、供体细胞的分离和处理、体细胞的核转移、重构胚胎的人工激活、胚胎体外培养和胚胎移植。由于该技术在最近几年的迅速发展,很多实验室已通过该技术成功获得了克隆猪后代。核移植克隆猪技术的出现为生产转基因猪提供了一种有效的方法,并且是目前生产基因打靶猪的惟一方法。至今利用克隆猪技术已经成功获得了一系列的转基因猪和基因敲除猪。以核移植技术产生基因修饰猪目前正处于从基础研究走向应用的过渡阶段。尽管猪体细胞核移植克隆的效率（出生克隆猪数占所用卵数的比例）还不高,但是由于通过该技术能够对猪基因组进行特定的修饰,确保生产的克隆动物100％为转基因动物,从而大大提高了转基因猪的制作效率,可以预料猪核移植技术将会对医药业和农业产生重大的影响。     

《细胞研究》:首例ROSA26基因敲入猪模型诞生

<正>近日,中科院广州生物医药与健康院研究员赖良学与美国密西根大学教授王忠合作,获得了世界首例ROSA26定点基因敲入猪模型。据称,该研究成功地实现了猪重组酶介导的基因交换,从而解决了一直困扰转基因猪研究领域效率低下、表型不确定的问题。相关研究成果日前在线发表于《细胞研究》。转基因猪在农业新品种培育和生物医药研究中具有非常重要的应用价值。长期以来,由于缺乏猪胚胎干细胞,转基因猪的制备主     

加强对转基因食品的管理可提高其安全性

转基因食品（Genetically Modified Foods．GM）是以转基因生物为原料加工而成的食品。对转基因食品安全性的争论主要集中于它对人和环境影响两个方面。其一是外源基因不是自然遗传的基因．它是否稳定．是否也像有害物质一样能通过食物链进入人体内．对人体造成意想不到的伤害。如食物过敏或者通过转基因作用而产生有害遗传性状对人的身体健康有害．或者发生有害基因的扩散。其二是转基因生物对农业和生态环境的影响如何。如抗病虫害的转基因作物在一定时期后可能使病虫产生抗性并且遗传．     

转基因动物研究及其产业化

转基因动物研究始于20世纪70年代,至今已在牛、羊、猪、鱼、猴和兔等动物身上取得转基因成功,并广泛用于生产药用蛋白、器官移植和抗病育种等领域,成为当今生命科学中最热门、发展最快的新兴产业。在论述转基因动物发展有利方面的同时,指出了其发展中面临的问题和今后研究的方向及发展前景。     

植物转基因沉默研究进展

随着转基因技术在植物中的广泛应用,转基因沉默受到越来越多的重视。转基因沉默可发生在转录和转录后两种水平,其基本特征就是依赖于同源的重复序列。转基因的重复拷贝间,转基因与同源的同源基因间及RNA病毒与同源转基因间都会发生基因沉默。可能有不同的机制导致转基因沉默。本文综述了转基因沉默的机理研究及转基因沉默在植物抗病基因工程和植物功能基因组方面的应用。     

基于专利分析的转基因药用植物技术发展趋势研究

据世界卫生组织不完全统计,药用植物在发展中国家和发达国家的使用量均逐年上升。随着对药用植物需求和消耗的不断增加,许多药用植物资源急剧减少。面对日趋严峻的药用植物资源,利用转基因技术进行品种改良,提高其有效成分含量成为研究的重要方向之一。基于德温特数据库的专利信息,对收录的有关转基因药用植物领域的专利文献进行统计分析,分别从全球和中国本土两个层面对转基因药用植物的研究现状、核心技术、研究热点、技术分布与格局等方面进行研究。结果表明,在转基因药用植物领域美国技术实力最强,而中国专利数量名列前茅,但其国际影响力尚且不足。研究结果为相关企业和科研机构掌握转基因药用植物的发展趋势提供必要的情报支持。     

转基因猪体内外源基因的整合鉴定

外源猪生长激素基因被导入湖北白猪．为避免羊、猪之间在金属硫蛋白启动上的同源性而造成PCR检测结果的假阳性,分别将PCR合成反应的两个引物设计在羊金属硫蛋白基因启动子一侧和猪生长激素一侧,使PCR合成反应的结果特异地反映外源基因的整合性,准确地鉴定出转基因猪．DNA印迹分析结果表明,43头待检仔猪中有6头呈外源基因整合阳性．     

转基因产品的安全性及其对应策略

目前,生物安全性问题已成为转基因技术及其产品能否获得足够的研究空间和良好开发市场的关键所在。然而,在重视安全性的同时,也必然认识到转基因技术及其产品的出现乃是人类社会发展的客观必然。当务之急不应该是简单地反对或赞成,而是必须对转基因产品进行全面、充分的研究和客观、具体的评价,从而使其在造福于人类的同时,能有效地减少或避免对人类健康及其生存环境可能产生的潜在危害。当然,对社会公众进行科学宣传和指导,从而使其在对转基因产品具有客观了解的基础上培养一种健康的接受心态也是必需的。本在简述转基因产品安全性及其研究现状的基础上,提出若干对应策略,希望能引起社会各界的共识。     

转基因低水平混杂问题——政策与内涵

转基因技术近年来在世界范围内快速发展,但由于不同国家在转基因审批上的不同步,以及各国设立严格的转基因低水平混杂阈值,导致正常的农产品贸易由于无意混入少量转基因成分而发生贸易摩擦,甚至导致贸易中断.从转基因低水平混杂(LLP)的含义出发分析其特殊性,分析了世界主要国家的LLP政策以及严格的LLP政策对贸易产生的负面影响.根据研究结果指出:在当前转基因作物采用率不断提高,以及转基因新品种研发加速背景下,转基因低水平混杂在技术上是不可避免的.因此,有必要在全球范围内建立转基因安全互信机制,各国需要尽量减少审批不同步时滞,设置合理的转基因低水平阈值,降低对正常贸易的负面影响.研究结果对中国转基因LLP政策和有关标准制定有一定借鉴意义.     

猪CD151转基因PK-15细胞系构建及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒的易感性

[目的]建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)易感的猪CD151转基因PK-15细胞系,研究CD151分子在PRRSV感染猪源细胞中的作用.[方法]用RT-PCR从猪肺泡巨噬细胞中扩增CD151全长cDNA,测序正确后克隆人真核表达载体pcDNA3;用重组载体pcDNA-CD151转染PK-15细胞,经G418抗性筛选获得转基因细胞系PK15-CD151,用RT-PCR和免疫荧光试验检测CD151表达;用VR-2332株PRRSV分别感染PK-15细胞、PK15-CD151细胞、MARC-145细胞和3D4-CD163细胞,定期观察细胞病变,用RT-PCR和免疫荧光试验检测病毒RNA基因组和病毒抗原,用半数组织细胞感染剂量测定病毒滴度.[结果]从猪巨噬细胞中克隆得序列正确的猪CD151 cDNA;从重组载体转染的PK-15细胞培养中筛选得G418抗性细胞克隆,并能正确表达猪CD151分子;在PRRSV感染后,PK15-CD151细胞虽然不表现明显的细胞病变,但能检测到病毒RNA基因组和病毒抗原,并能产生较高滴度的感染性病毒;该细胞系已在体外传30代以上,第10、20、30代细胞的PRRSV滴度无明显变化.[结论]猪CD151基因转染能使非易感PK-15细胞获得对PRRSV的易感性,提示猪CD151参与PRRSV感染猪源细胞.     

一种改进的显微注射用DNA片段的纯化方法

目的显微注射用DNA的纯度是影响转基因动物制备成功与否的重要因素,本文建立一种可行的适用于普通实验室的纯化DNA方法,替代普遍使用的试剂盒纯化方法。方法分别使用酚-氯仿多次抽提法及常规的凝胶提取试剂盒纯化含有蚓激酶基因的DNA片段,通过显微注射技术将纯化的DNA片段导入小鼠受精卵的原核,制备转基因小鼠。根据转基因实验的结果对两种方法进行比较。结果使用两种方法纯化DNA均能获得转基因小鼠。在DNA纯度及注射卵的存活率上,两种方法无明显差别;在移植卵的出生率及转基因阳性率上,抽提法优于试剂盒法。结论本实验建立的抽提方法可以替代试剂盒方法纯化显微注射用DNA片段,在降低实验成本、简化实验条件及提高转基因阳性率方面具有优势。     

转基因猪研究进展

转基因猪是指运用分子生物学技术方法,将人工分离或改造过的基因整合到猪的基因组中,并能稳定的遗传给后代。转入的基因可以使猪的某些性状向人类需要的目标发生转变,因此在猪的遗传育种、以及将猪作为药物评价、疾病模型、特异性药物生产的生物反应器和组织器官移植的供体等方面具有重要的作用。就目前转基因猪的研究进展、技术方法及应用现状进行简要的综述。     

植物标记基因种类多样发展

转基因技术发展极为迅速,此前已获得极大经济和社会效益,产生的影响国备受国内外关注。我们可以清楚地看到技术本身在商业、科技方面的应用,而应用在同时转基因技术在研究、实践上已经遇上了重重困难。探究标记基因多样性将为未来转基因技术带来新的突破口。本文概述并评价了现阶段构建标记基因和无标记基因两种系统的热点标记基因,并分析其技术难点提出展望。     

基于四环素调控系统的ApoE-rtTA/TRE-HCV-C双转基因小鼠的制备

目的为了丰富现有的四环素调控系统的小鼠资源库,同时也为更好地研究目的基因HCV-C的作用机制提供一个活体的动物模型,制备基于四环素调控系统原理的调控部分ApoE-rtTA的转基因小鼠,与反应部分TRE-HCV-C转基因小鼠,相互交配制作出双转基因小鼠。方法应用显微注射法将构建好的两种基因片段ApoE-rtTA及TRE-HCV-C分别注入超排的昆明母鼠的受精卵,再植入假母输卵管,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,将两者及阳性后代交配产生携带5只转基因鼠再经Western blot和RT-PCR在RNA和蛋白水平上进一步鉴定。结果产生了3只整合有ApoE-rtTA基因的首见鼠和125只阳性子代,以及产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首见鼠和16只阳性子代。PCR及Southern Blot证实上述阳性鼠确有转基因整合。将两者交配产生携带5只双转基因鼠。结论成功制备了携带有ApoE-rtTA及TRE-HCV-C转基因小鼠,建立了分别携带有这两种基因的鼠群,以及同时携带有两种基因的双转基因小鼠,为四环素调控系统提供了一个良好的通用型的调控动物模型,同时也可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

转基因植物的研究概况及应用领域

就转基因技术在作物育种上的研究、应用状况、应用领域以及产生的经济、社会和环境效益几方面进行了概述。     

转基因与非转基因大豆油主要营养成分比较分析

为了解消费者对转基因食品的认知消费情况,在河南地区消费者调研的基础上,对转基因和非转基因大豆油的主要营养成分进行了比较分析。结果表明：63.41%的被调查者听说过转基因食品,其中认为转基因食品对人体健康和环境影响长期短期均有害的占36.22%、自己不会购买转基因食品的占64.4%。转基因和非转基因大豆油在脂肪酸、维生素E和甾醇的种类上一致,其中非转基因大豆油中α-亚麻酸的含量显著高于转基因大豆油,其余各组分含量在两者中差异不显著;两者脂肪酸总量中不饱和脂肪酸占比超过80%,β-谷甾醇在甾醇中的含量最高。综上,消费者对转基因食品认知度、关注度较高,转基因和非转基因大豆油在主要营养成分上差异不明显。本研究为转基因食品的安全性评价和政府制定监管政策提供科学依据。     

防止转基因作物释放引发“超级杂草”产生的若干对策

转基因作物释放可能导致潜在的生态风险性,其中的一个重要方面是通过花粉的传播将某些转基因（主要是抗除草剂基因）漂入野生近缘种或近缘杂草而引发难以控制的“超级杂草”的产生。本文讨论了防止“超级杂草”产生的若干对策,包括物理隔离、转基因遗传调控、雄性不育性与无融合生殖机制的利用、将转基因定位于同当地杂草不亲和的基因组和叶绿体或线粒体基因组等。     

转基因RNAi技术在动物抗病毒育种中的应用

病毒对动物和人类健康都是极大的威胁,抗病毒疫苗虽然能在一定程度上预防病毒病,但目前几乎还不能对变异的传染病进行抗病毒治疗。尽管RNA干扰研究到目前才短短十几年,其作用机理已基本清楚。RNAi能够非常有效的抑制病毒体内复制,其介导的抗病转基因动物的研究相继取得了阶段性进展,抗疯牛病转基因羊和牛,抗内源性逆转录病毒猪以及抗核型多角体病毒病的转基因家蚕已经成功获得。尽管如此,目前的研究主要还是集中在细胞水平及小鼠模型方面,获得的转基因动物种类和数量有限,但为培育动物抗病毒品种提供了理论依据和技术支撑。随着转基因技术的不断的进步和成熟, RNA干扰技术将成为动物抗病毒育种中最有应用前景的方法之一。     

转基因猪染色体原位杂交外源生长激素基因定位

近些年来随着原位杂交技术的不断改进,该技术已广泛用于染色体的基因定位。非放射性标记探针的应用使基因定位变得更加简单易行,从而有可能对动物的转基因进行定位研究。本文首次采用胶体金标记药盒（Anti-digoxigenin-gold)和银加强试剂（Silver enhance-ment reagents)的非同位素原位杂交技术对转基因猪外基因进行了定位研究。如Fig.1所示：表达质粒pSMTPGH含有载体pUC19,羊启动子MT011和猪生长激素PGH基因。选5头带有pSMTPGH的转基因猪,分别制备含有染色体DNA的杂交膜。用BglII和Smai对pSMTPGH进行完全酶切,收集0．9kb片段作为探针,以dig-11-dUTP进行标记。探针与DNA杂交后,用光学显微镜检查。选择分散良好、显影银颗粒清楚的玻片进行摄影记录（Fig.2)。对染色体上的显影银颗粒进行统计分析,参照家猪的染色体标准带型,确定外源PGH基因整合位点。Fig.3为4104号转基因猪染色体上的银颗粒分布情况。对5头转基因猪外源PGH基因定位的结果见Table1。探针的合理设计是外源基因定位研究成功的关键。本实验所用探针必须地与外源PGH基因杂交,而不受内源PGH基因的影响。我们设计的探针符合这一要求。采用dig11－dUTP标记探针,抗体金显色,银加强试剂放大杂交信号,在光学显微镜下可以直接观察杂交位点处的显影银颗粒,但于对实验进行统计分析。估计数据表明：转基因猪的外源PGH基因随机整合在所有染色体上,但在13号染色体上的机率略高。     

外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性

转基因技术经过近半个世纪的发展,已成为当今生物技术研究的热点。近10多年来,与核移植技术的结合,转基因效率大大提高,携带有不同外源基因的不同种类的转基因动物迅速增加。但是,成功获得转基因动物并不是转基因动物研究的最终目的,如何利用转基因技术为人类的需求服务才是科研人员始终面对的课题。在畜牧生产领域,通过转基因技术培育家畜新品种是转基因技术应用的重要体现,在我国这方面已经引起了广泛关注。但迄今为止,外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性仍然是亟待解决的问题,究其原因,这主要与位置效应、外源基因的表观遗传学修饰和遗传效率相关,文章结合目前的研究进展和本实验室的研究结果,从这3方面阐述其作用机制,期望为转基因动物遗传育种向产业化的迈进提供一定的理论探讨。