人中性粒细胞多肽HNP1,3体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的作用

体外观察人中性粒细胞多肽1,3(Human neutrophil peptide,HNP1,3)及阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)对单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus 1,HSV-1)的抑制作用.以Vero细胞为靶细胞,用各种浓度HN1,3与游离病毒颗粒(直接失活组)及感染病毒后的靶细胞(复制抑制组)进行相互作用,镜下观察各药物对HSV-1致细胞病变效应的抑制作用,并采用ELISA法测定感染48h后药物对HSV-1囊膜糖蛋白分泌的抑制作用.MTT法检测各药物对细胞的毒性作用.结果显示直接失活组中,HNP1,3可使HSV-1的致细胞病变效应减轻,对HSV-1直接失活的50%有效浓度(ECs0)为8.1μg/mL、10.03μg/mL;复制抑制组中,ACV使HSV-1的致细胞病变效应减轻,EC5o为0.68μg/mL.MTT检测结果表明HNP1,3在治疗浓度范围内无明显细胞毒性.以上结果表明HNP1,3除具有较强的抗菌作用和抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)活性外,还能失活HSV-1病毒颗粒,从而逆转病毒及其蛋白的病毒效应(致细胞病变)和抑制病毒蛋白质的合成.     

单纯疱疹病毒Ⅰ型最新研究进展——病原学、防控及应用

单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus 1,HSV-1)感染可引起广泛的临床症状,包括口腔感染造成的组织损伤,以及严重的中枢神经系统感染造成的脑炎.HSV-1的研究每年都有突破性进展,其病原学、感染引致慢性炎症、抗病毒制剂,以及作为微生物工具用于治疗肿瘤的研究,引起了业界同行的广泛兴趣.本文对HSV...     

2型单纯疱疹病毒体外感染周期的研究进展

2型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)是引起生殖器疱疹的主要病原体。生殖器疱疹主要表现为生殖器和肛周皮肤黏膜疱疹或溃疡,是一种慢性、复发性、难以治愈的性传播疾病,临床治疗多以抑制病毒复制的核苷类药物阿昔洛韦及其衍生物更昔洛韦、喷昔洛韦等为主。这些药物对缓解症状、缩短病程有一定作用,但难以达到根治的目的,长期应用易产生耐药,且对其合并症基本无效。作用于HSV-2其他感染周期的药物成为人类探索的新领域。HSV-2感染宿主细胞是一个复杂的多阶段过程,包括黏附、穿入、核转运、基因组复制、衣壳组装、子代病毒释放等多个步骤,涉及多种细胞和病毒蛋白的活性。本文对HSV-2体外感染周期详细步骤及其分子机制作一综述,以期深入了解其感染机制,并为研制作用于不同感染阶段的抗HSV-2药物提供参考。     

单纯疱疹病毒1型VP16蛋白和VHS蛋白研究进展

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)为有包膜的DNA病毒,能引起皮肤性疱疹、角膜炎、脑炎等症状.HSV-1感染细胞后,要么进入裂解性感染阶段,要么进入潜伏感染阶段.受感染的细胞常会启动免疫系统抵抗病毒,而病毒却通过某种机制巧妙地逃避宿主的免疫反应并进入潜伏.进入潜伏感染阶段的病毒又会因机体受某种刺激而被激活进入裂解感染期.在这期间,有两个关键的病毒蛋白一间层蛋白(Viral protein 16,VP16)和内膜蛋白(Virion host shutoff protein,VHS)倍受关注,它们既是HSV-1的结构蛋白,在病毒复制晚期参与病毒颗粒的组装,同时又作为重要的功能蛋白,在病毒感染早期发挥重要的转录调节功能.下面就这两个蛋白相关功能的研究进展作一简要综述:     

单纯疱疹病毒1型VP16蛋白和VHS蛋白研究进展

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)为有包膜的DNA病毒,能引起皮肤性疱疹、角膜炎、脑炎等症状。HSV-1感染细胞后,要么进入裂解性感染阶段,要么进入潜伏感染阶段。受感染的细胞常会启动免疫系统抵抗病毒,而病毒却通过某种机制巧妙地逃避宿主的免疫反应并进入潜伏。进入潜伏感染阶段的病毒又会因机体受某种刺激而被激活进入裂解感染期。在这期间,有两个关键的病毒蛋白一间层蛋白(Viral protein16,VP16)和内膜蛋白(Virion host shutoff protein,VHS)倍受关注,它们既是HSV-1的结构蛋白,在病毒复制晚期参与病毒颗粒的组装,同时又作为重要的功能蛋白…     

单纯疱疹病毒Ⅰ型新开放读码框UL57的鉴定

单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)潜伏感染期间LATs的活跃转录可能与其启动子与增强子两侧的CTCF结合序列有关。本研究对位于UL56下游与LAT启动子上游之间并与CTCF结合序列重叠存在的一个新开放读码框(本研究中命名为UL57)进行了鉴定。首先利用HSV-1(F)细菌人工染色体(HSV-BAC)系统构建重组病毒HSV-EGFP-UL57,将EGFP序列插入UL57 5’端;然后分别通过Northern Blot和Western Blot检测EGFP标记的UL57的转录和表达;同时构建敲除UL57的重组病毒HSV-ΔUL57,观察UL57对病毒增殖的影响。结果显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57感染HEp-2细胞17h后,EGFP探针检测到两条转录产物,其中1.8kb转录产物与预测大小相符;使用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)阻断病毒即刻早期蛋白/早期蛋白合成后,UL57转录受到明显抑制。重组病毒HSV-EGFP-UL57感染Vero细胞后,9h可见融合蛋白表达,24h表达明显;融合蛋白分子量与预测大小(58kD)一致。病毒生长曲线显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57及HSV-ΔUL57在Vero细胞中的增殖水平与HSV-1(F)基本一致。本研究表明,在HSV-1基因组(GenBank:GU734771.1)UL56下游与LAT启动子上游之间存在一个新开放读码框UL57(116 921bp～117 799bp),UL57可以进行转录,且其转录受病毒即刻早期蛋白/早期蛋白调控;转录产物可以翻译出融合蛋白,但表达水平较低。删除UL57对病毒增殖无明显影响。     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录酶在大肠杆菌中的表达及其初步纯化

Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录酶(RT)在抗病毒感染及AIDS治疗药物的设计中是一个重要的靶分子,并且可作为工具酶应用于逆转录PCR等分子生物学研究中。本研究将HIV-1RT基因经PCR扩增并修饰后克隆入大肠杆菌表达载体pBV220,所获重组子所表达的HIV-1RT蛋白占菌体总蛋白的8％左右,且经[~3H]dTTP掺入法证实该重组HIV-1RT具有RT聚合酶活性。用Q-Sepharose层析柱对重组HIV-1RT蛋白进行了初步纯化,所获纯化样品的RT聚合酶比活性(1.7×10~4U/mg)比纯化前的裂解上清提高612倍。     

单纯疱疹病毒1型单链结合蛋白ICP8研究进展

在单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1,HSV⁃1)中,感染细胞蛋白8(Infected cell protein 8,ICP8)是由UL29基因编码的一种单链DNA结合蛋白(Single strand DNA⁃binding protein,SSBP),该蛋白在病毒复制中必不可缺,具有维持单链DNA的稳定性,并与其他病毒蛋白相互结合,促进病毒复制室的形成,介导晚期基因的表达。除此之外,ICP8还具有促进UL9编码的起源结合蛋白(Origin binding protein,OBP)和UL5/UL8/UL52蛋白的酶活性,与UL12蛋白共同介导链交换等功能。本文就上述目前国内外对HSV⁃1 ICP8的研究进展作一综述,以期为后续研究ICP8的作用机制提供参考。     

北京地区猫疱疹病毒Ⅰ型的分离及鉴定

了解北京地区猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)毒株特点,为猫疱疹病毒Ⅰ型的进一步研究及对猫的感染预防控制奠定基础。经特异性PCR检测为FHV-1阳性临床猫眼鼻拭子,经过处理,接种CRFK细胞,通过细胞培养分离病毒。通过间接免疫荧光试验、电镜形态观察、病毒毒力测定及基因序列分析等对分离株进行鉴定。PCR检测FHV-1阳性的14只猫眼鼻拭子接种CRFK细胞,有6只猫样本能使CRFK细胞发生圆缩、拉网集聚等病变;6个样本接种的CRFK病变细胞滴片进行免疫荧光试验,均产生绿色荧光反应;经传代培养,有5株分离株能够稳定传代,其中有2株弱毒,3株强毒;电镜下5株分离株均可见直径100~160nm的球型病毒粒子;5株分离株与FHV-1标准株C-27及2个不同公司来源疫苗株gB、gD基因核苷酸比较同源性均为99%以上。实验室成功分离保存5株能稳定传代的FHV-1毒株,5株分离株与FHV-1标准株及2个疫苗株亲缘关系很近。     

单纯疱疹病毒1型立即早期蛋白ICP22研究进展

单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1,HSV-1)感染细胞蛋白22(Infected Cell Protein 22,ICP22)是Us1基因编码的一种翻译后修饰多功能蛋白,为HSV-1的五种立即早期蛋白之一。HSV-1 ICP22能与不同的细胞和病毒成分相互作用来执行不同的功能,包括改变RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ/PolⅡ)的磷酸化状态、参与抵抗细胞对病毒复制的消极作用、引起细胞周期蛋白A和B水平降低、介导修饰拓扑异构酶Ⅱα、参与胞核内病毒诱导的分子伴侣富集(Virus-induced chaperone-enriched,VICE)区域的形成及促进病毒新生核衣壳的初次包装。这些作用大多与调节病毒在胞核中有效复制相关。此外,HSV-1 ICP22还在限制细胞中的病毒复制、病毒致病力和潜伏感染建立过程中发挥重要作用,但ICP22发挥这些作用的机制尚未知。本文就上述目前国内外对HSV ICP22的研究进展作一综述,以期为后续研究提供参考。     

Molecular Determinants Responsible for the Subcellular Localization of HSV-1 UL4 Protein

The function of the herpes simplex virus type 1 (HSV-1) UL4 protein is still elusive.Our objective is to investigate the subcellular transport mechanism of the UL4 protein.In this study,fluorescence microscopy was employed to investigate the subcellular localization of UL4 and characterize the transport mechanism in living cells.By constructing a series of deletion mutants fused with enhanced yellow fluorescent protein (EYFP),the nuclear export signals (NES) of UL4 were for the first time mapped to amino ac...     

Host Cell Protein C9orf9 Promotes Viral Proliferation via Interaction with HSV-1 UL25 Protein

In light of the scarcity of reports on the interaction between HSV-1 nucleocapsid protein UL25 and its host cell proteins,the purpose of this study is to use yeast two-hybrid screening to search for cellular proteins that can interact with the UL25 protein.C9orf69,a protein of unknown function was identified.The interaction between the two proteins under physiological conditions was also confirmed by biological experiments including co-localization by fluorescence and immunoprecipitation.A preliminary study...     

Expression of HSV-1 ICP0 Antigen Peptide in Prokaryotic Cells and Preparation of Specific Antibody

As an immediate-early protein of herpes simplex virus, infected-cell polypeptide 0 (ICP0) exhibits complicated interactions with host cells, and its regulatory function on gene expression is of great importance. Since the ICP0 encoding sequence contains many rare codons which are absent in E.coli, and ICP0 is highly unstable in prokaryotic cells, expression of entire ICP0 in prokaryotic cells has never been reported. In order to further investigate the function of ICP0, a recombinant plasmid was constructed by subcloning a cDNA fragment encoding an amino-terminal of 105 residues of the ICP0 protein into pGEX-5x-1 vector. The resulting GST-105 fusion antigen peptide was expressed with high efficiency in E.coli. Antibodies prepared after the immunization of mice with purified fusion protein can recognize not only the denatured ICP0 protein, but also the native ICP0 protein with normal biological conformation.     

Expression of HSV-1 ICP0 antigen peptide in prokaryotic cells and preparation of specific antibody

As an immediate-early protein of herpes simplex virus, infected-cell polypeptide 0 (ICP0) exhibits complicated interactions with host cells, and its regulatory function on gene expression is of great importance. Since the ICP0 encoding sequence contains many rare codons which are absent in E.coli, and ICP0 is highly unstable in prokaryotic cells, expression of entire ICP0 in prokaryotic cells has never been reported. In order to further investigate the function of ICP0, a recombinant plasmid was constructed by subcloning a cDNA fragment encoding an amino-terminal of 105 residues of the ICP0 protein into pGEX-5x-1 vector. The resulting GST-105 fusion antigen peptide was expressed with high efficiency in E.coli. Antibodies prepared after the immunization of mice with purified fusion protein can recognize not only the denatured ICP0 protein, but also the native ICP0 protein with normal biological conformation. Foundation items: National natural science foundation items (30570081 and 30670094)     

A new N-methyl thymine derivative comprising a dihydroxyisobutenyl unit as ligand for thymidine kinase of herpes simplex virus type 1 (HSV-1 TK)

Molecular modeling and phosphorylation assay in vitro were employed to select a novel unsaturated 1,3-dihydroxyisobutenyl thymine derivative 6 as ligand for HSV-1 TK which may be of interest as lead for the development of an positron emission tomography (PET) imaging agent. Compound 6 was successfully prepared using modified approaches. A significant improvement over the syntheses involving pathways A and B (1% and 3% overall yield, respectively), was observed using synthetic route C (14% overall yield).     

靶向ICP4的小干扰RNA对HSV-1病毒复制能力的影响

HSV-1是一种嗜神经病毒,能引起一系列神经系统严重症状,然而目前抗HSV-1药物易反弹、不能完全清除潜伏的病毒。ICP4对HSV复制、转录起主要调节作用,决定着溶细胞型感染或潜伏状态的平衡点。为了探寻新的抗病毒策略,本课题以HSV-1ICP4基因为靶点,设计合成2对siRNA,并构建重组真核慢病毒表达质粒pL-KO-puror-hU6-siRNA,通过脂质体转染和嘌呤霉素筛选建立靶向ICP4的4个siRNA单克隆细胞系,Real-timePCR法检测细胞系中ICP4的mRNA表达水平,TCID50法检测siRNA对HSV-1病毒复制能力的影响。结果显示靶向siRNA能有效抑制单克隆细胞系中的ICP4表达,并且抑制ICP4的表达后HSV-1病毒复制能力明显减弱,表明靶向ICP4的siRNA对HSV-1复制有明显抑制作用,且多位点siRNA联合干扰对病毒复制有协同抑制效果,有望应用于生物抗病毒药物的制备。     

HSV体外感染对IgG产生的抑制作用和TNF及r-IFN对它的影响

本文观察了体外HSV-I感染对人淋巴细胞增殖、分化,产生免疫球蛋白的影响。HSV-I能感染PWM刺激的人扁桃体淋巴细胞,并抑制其增殖和免疫球蛋白(IgG)的产生,感染实验组的IgG产量较对照组明显降低(P<0.005)。HSV-I感染后,上清中可检出一定量的病毒,其滴度为10~(3·2)—10~(5·7)TCID50/ml;直接免疫荧光法检出病毒抗原阳性细胞为3％—8.5％。在感染实验系统中加入重组的IFN_a(r-IFN_a)、IFN_γ(r-IFN_γ)和纯化的肿瘤坏死因子(TNF),观察到r-IFN。和TNF均有一定程度抗病毒作用,部分解除HSV-I对IgG产生的抑制作用。和对照组相比,差异显著(P<0.01)。r-IFN_γ对HSV-I的感染和IgG产生几乎无作用(P>0.05),但r-IFN_γ对TNF有协同作用:抑制病毒增殖和解除HSV-I对IgG产生的抑制,比单独用TNF组更为显著(P<0.01)。