细菌和放线菌质粒DNA的分离

到目前为止,所发现的细菌和放线菌的质粒DNA都是共价闭合超盘旋的环状结构。它的碱基组成与染色体DNA不同,分子量较染色体DNA小得多,有的质粒可以通过接合作用有效地转移到受体细胞中去。常利用质粒的这些特性来分离它们。现将几种分离质粒的方法介绍如下。     

用凝胶电泳纯化具有生物学活性的质粒DNA

采用一般柱电泳装置,在琼脂糖凝胶上将质粒ColEl、pBR322、pSC101、pCRI的DNA与染色体DNA及小分子核酸杂质分开,切出含有质粒的凝胶薄片,电洗脱回收质粒DNA,产物可被限制酶Eco RI酶解;将pBR 322、PSC 101、pCRI DNA转化大肠杆菌C_(600),每微克DNA可产生10~4个转化子;从pSC 101、pCRI转化子细胞中再抽提出相应质粒,它们同样具有亲本质粒的遗传特性和分子特性。     

关于痢疾菌苗的研究现状(续)

<正>下面讨论志贺氏菌质粒的基因产物。这是Hale的初步工作及志贺氏菌毒株与侵袭性大肠杆菌微细胞的初步应用。由于会出现分裂不完善的突变体,致使其细胞的一部分分裂后不能遗传染色体DNA,细胞发芽部分太小不能包含染色体,只能包含大质粒。微细胞可以从营养细胞中分离到,在这些种群中从新合成蛋白质的是由质粒而不是染色体DNA。来自弱毒亲本的微细胞不能侵入     

一种简单实用的适于大、小质粒的DNA提取方法

以Birabolm和Doly的质粒提取方法为基础,用醋酸铵取代醋酸钠,沉淀染色体DNA和RNA,用异丙醇取代乙醇沉淀质粒DNA,降低了质粒DNA标本中蛋白质和RNA的含量,减少了标本体积。并发现在质粒DNA标本中加入冷异丙醇或冷乙醇后,在-70℃、-20℃、-10℃、4℃和室温下作用,对质粒DNA的回收量无明显影响,在质粒DNA标本中加入冷异丙醇后,在4℃作用0、10、20和30分钟,对质粒DNA的回收量无明显影响。用该方法提取的质粒DNA可直接用于限制性内切酶消化。用该方法提取大肠埃希氏菌     

质粒在细菌致病性中的作用与新菌苗研制的展望

<正>一、质粒 1.基本性质:质粒是广泛存在于原核细胞中的一种复制子,是独立于染色体之外的双链超螺旋DNA,它的复制不受染色体的控制。它的存在与消失一般不影响细菌的存亡。只影响某些性状的有无。 细菌染色体的分子量约在10~9的数量级而质粒只有10~6左右,最大的也只有10~8数量级。根据质粒的大小,一般可分为     

整合及游离状态的链霉菌质粒pLE1的研究

质拉pLEI以整合形式存在于宿主菌变青链霉菌染色体上,通过DNA转化宿主菌原生质体, 导 致了宿主染色体上的整合序列的环出而形成游离质粒DNA分子。初步探讨了质粒pLEI的理化特 性,确认pLEI与质粒PIJ101是同一系列。     

细菌质粒的复制

细菌的主要结构和功能是由染色体控制的,而一些非主要特征则由于独立的复制子(称为质粒)的存在而产生的。质粒(plasmids)是染色体外的环状双链DNA。它能独立于染色体而稳定存在。然而,许多质粒还可能与染色体共价结合,成为染色体环的一个组成部分。质粒大小,从分子量为一百万(只能编码二、三     

线形质粒

质粒是染色体外的遗传因子,是一种双链环状的DNA分子,质粒本身含有复制的遗传结构,能在细胞质中独立自主地进行自我复制。它是一个复制子。一些质粒也能整合到细菌染色体中随染色体的复制而复制。质粒一般都带有某些抗性基因。     

枯草芽孢杆菌中的分子克隆和单体杂种质粒转化的研究

枯草芽孢杆菌感受态细胞的质粒转化与质粒的分子构型有关。用琼脂糖凝胶电泳法分离纯化的pUB110质粒DNA单体是很少或没有转化活性的。在pUB110质粒DNA上插入一段受体菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体可以转化感受态细胞,但受体菌必须是重组型的。转化效率和插入片段的大小有关,片段愈大转化活性愈高,片段小于0.6kb,就和pUB110DNA单体一样,几乎没有转化活性。在pUB110质粒DNA上插入一段解淀粉芽孢杆菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体转化效率都很低。本文还讨论了用鸟枪法在枯草芽孢杆菌中进行分子克隆的一些问题。     

用人造微小染色体技术研究着丝粒和端粒的DNA结构与功能

为了在细胞世代中保持其稳定性,染色体起码应具备3个结构要素,那就是有一个DNA复制起点;一个着丝粒(ccntromere)使细胞分裂时两个姊妹染色单体能平均分配到子细胞里;最后,在染色体的两个末端必须有端粒(telomere),使DNA能完成复制。近年来人们采用分子克隆技术把真核细咆染色体的复制起点、着丝粒和端粒的DNA片段分别克隆成功。并且把它们互相搭配或改造而构成所谓“人造微小染色体”(aftificial minichromosomes),以研究这3种成分的结构与功能。 一、染色体复制起点 大肠杆菌质粒pBR322不能转化酵母细胞,因为pBR322上的DNA复制起点不能被酵母系统所识别,DNA不能复制。1979年Stinchcomb和Carbon实验室分别把带有遗传标记,例如Trp~+的酵母DNA的EcoRI片段插入pBR322,用来转化trp~-酵母,获得了带有质粒并能传代的Trp~+细胞。它们所含的质     

乳链球菌Z270乳糖－蛋白酶质粒pUCL22的消除及其整合

用简单的温和法消除乳链球菌Lactococcus lactis sub sp．Lactis Z270的乳糖-蛋白酶质粒pUCL22(54kb)。DNA普通琼脂糖凝胶电泳图和生化检验证明,变异菌株D16和D17的质粒pUCL22被消除了。脉冲电泳图表明,D16的染色体限制酶图谱与野生菌Z270的相似,但D17的染色体被质粒的蛋白酶基因多位点整合,从而改变了其染色体限制酶的酶切图。     

一种简易的制备和纯化质粒DNA的方法

近年来随着遗传工程的飞速发展,DNA重组技术被广泛应用,许多实验室在制备一定纯度、产量较高、方法简便的质粒DNA方面作了许多工作。国外大多数实验室普遍采用CsCl等密度梯度超离心法,但国内受仪器限制,应用较少。我们比较了PEG沉淀质粒DNA, 羟基磷灰石法制备质粒DNA,快速抽提质粒DNA,以及M.A.K柱制备质粒DNA等方法,它们都各有利弊。本实验室对L.P.Elwell的实验条件稍作改进,温和地制备清亮裂解液并抽提质粒DNA,然后应用Sephacryl S-1000作凝胶过滤,获得了纯度高、产量大,无染色体DNA     

信息库

1.用电穿孔法进行黑曲霉的转化作用 用电穿孔法可以将DNA转入完整的黑曲霉萌发分生孢子。此法不仅简单快捷,转化子菌落出现的时间也比原生质体转化法早些。分生孢子不经预处理,转化频率为1.2菌落/μg整合载体,或100菌落/μg质粒DNA。若将分生孢子用稀的真菌细胞壁分解酶溶液预处理,转化频率大约可提高两倍。用DNA贴印法分析染色体DNA,和用转化子DNA的限制性DNA图谱分析表明,整合载体已通过同源或非同源整合到染色体组中。这个结果和用原生质体转化法相同。在质粒DNA转中,无论电穿孔法或用常规方法,转化子中的质粒DNA大多数呈游离状态,只有很少数整合到染色体上。     

CTAB选择性沉淀和纯化质粒DNA工艺的建立

通过直接在大肠杆菌碱裂解上清中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB), 优化CTAB与质粒DNA量的比例、质粒DNA选择性释放溶液的选择和TritonX-114的使用, 建立了简单、易行的大规模质粒DNA纯化工艺。纯化质粒DNA的质量检测结果显示, CTAB纯化的质粒DNA无菌体RNA污染, 菌体基因组DNA、内毒素和蛋白含量分别小于 100 ng/mg、50 EU/mg和10 mg/mg质粒DNA, OD260/OD280比值介于1.75~1.85之间, 超螺旋质粒DNA的比例大于80%, 该工艺纯化的质粒DNA能达到或接近FDA规定的人用质粒DNA的各项指标, 整个过程不使用动物源性酶和苯酚、氯仿、无水乙醇等有毒或易燃、易爆试剂, 成本低廉, 工艺环保。     

线性质粒

在染色体外DNA分子的研究领域中,一支异军正在悄悄突起,这就是线性质粒的研究。 迄今报导的多数质粒都是环状的DNA分子。近年来,人们相继在真核生物中发现了一些线状质粒。例如,玉米线粒体中的SⅠ和SⅡ质粒(1,2)、Sarghum线粒体中质粒(8)、真菌Ascobolus immersus中的质粒。     

染色体特异DNA文库的构建与鉴定

为构建人类21号染色体特异DNA文库, 以应用于人类遗传疾病的鉴定和研究, 文章采用循环温度梯度法溶解释放微分离的人外周血细胞21号染色体DNA, 将其进行简并寡核苷酸引物PCR(Degenerate oligo nucleotide primer-PCR, DOP-PCR)扩增后, 利用100~500 bp和500~2 000 bp分段回收纯化的两种不同片段大小的DOP-PCR产物构建染色体特异DNA文库, 并分别采用荧光原位杂交(Florescence in situ hybridization, FISH)和斑点杂交对DOP-PCR产物的来源和随机取样的文库克隆进行检测以评估所构建DNA文库的特异性。结果表明: 循环温度梯度法能有效溶解释放微分离的21号染色体DNA; 通过对DOP-PCR产物的分段回收纯化和克隆, 增加了大片段DNA的连接效率; 利用FISH技术和斑点杂交双重鉴定实验证明了文库的特异性, 从而构建了21号染色体特异的DNA文库, 并建立了构建染色体特异DNA文库及检测其特异性的方法, 为21号染色相关遗传疾病的鉴定和研究奠定了基础。     

六株成团肠杆菌 (Enterobacteragglomerans)接合子的分子生物学分析

对 6株成团肠杆菌 (Enterobacteragglomerans)接合子的分子生物学进行了分析 .6株菌与nifHDK基因有杂交 .菌株总DNA经BamHⅠ酶切后与pEA9 DNA进行Southern杂交 ,只有 2株菌具有完整的质粒DNA ,其余菌株质粒DNA发生了 15 3～ 137 7kb不同程度的缺失 .用切割位点较少的限制性内切酶XbaⅠ酶切 6株菌的总DNA ,经脉冲场凝胶电泳 (PFGE)后用pEA9 DNA为探针进行Southern杂交 ,每株菌的pEA9 DNA明显大于用BamHⅠ酶切后的杂交结果 ,表明质粒与染色体发生了整合 .转座子Tn5或插入序列IS 12 2 2和IS 12 71可能参与质粒与染色体的整合过程 .     

AZI基因被捕获的鉴定实验

目的 确立基因捕获细胞中被捕获的基因名称. 方法 Southern印迹确定合适的限制性内切酶,用质粒拯救（plasmid rescue）获得含有细胞染色体DNA的质粒,测序.结果 本次实验中,被捕获载体整合的基因是AZI基因. 结论质粒拯救方法能确立质粒整合细胞染色体上准确的位置.     

一种改进的快煮制备质粒DNA和噬菌体DNA的方法

质粒DNA和噬菌体DNA的提取,是基因操作过程中最基本的、也是比较重要的一个步骤。而制备纯度高的制品,缩短操作时间,又是人们普遍感兴趣的。提取闭合环状共价DNA(cccDNA)(包括质粒DNA和噬菌体DNA)的基本原理是利用大分子染色体DNA片段与环状共价DNA的理化性质差别来进行的,方法多种:SDS法,酸酚法,PEG法,煮     

谷氨酸棒状杆菌启动子在枯草芽孢杆菌中的克隆及其序列分析

利用枯草芽孢杆菌启动子探针质粒pPL 603为载体,从谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA上克隆到一个有较强启动功能的DNA片段。生物素标记的DNA—DNA分子杂交实验证明该片段确实来自谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA。在绘制该片段限制酶酶切图谱的基础上,经另一个启动子探针质粒pPL 703的亚克隆,将其启动子功能区定位在Bamm酶切片段中。对后者进行了核苷酸序列分析,发现它具有棒状杆菌类启动子的－35区和－10医序列。