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1.
以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得HspX基因,通过DNA无缝克隆技术将其克隆至pET28a质粒中,构建重组表达质粒pET28a-HspX。将pET28a-HspX转化至大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3),采用不同温度、IPTG浓度和时间诱导HspX蛋白表达。使用Ni-IDA亲和层析柱纯化目的HspX蛋白,透析去除咪唑,通过Western blot检测HspX抗原特异性。最终确定表达重组蛋白HspX的最佳诱导条件为:诱导温度37℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导时间8 h。结果表明,获得了高纯度和被特异性识别的可溶性Hsp X蛋白,为未来Hsp X蛋白用于结核病诊断试剂和疫苗奠定基础。 相似文献
2.
《生物技术通报》2015,(7)
铜绿假单胞菌外膜蛋白Opr I具有较强的免疫原性,在疫苗上具有开发前景。利用分子方法获得Opr I蛋白的表达菌株。Western blotting验证表明抗体能与Opr I蛋白特异性结合。SDS-PAGE电泳切胶纯化获得Opr I蛋白。将Opr I蛋白免疫小鼠并攻毒铜绿假单胞菌,发现Opr I蛋白激活的特异性免疫对小鼠铜绿假单胞菌感染的保护率达到57.14%,与对照组相比较达到显著性。采用正交试验设计,获得Opr I菌株最佳诱导表达条件为:加IPTG菌夜OD600值0.8,加IPTG终浓度0.3 mmol/L,诱导时间8 h,诱导温度28℃;菌株最佳培养条件为转速230 r/min,葡萄糖浓度0%,装液量50 m L。 相似文献
3.
目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基因,构建重组表达载体PET30a-L1,通过优化表达在大肠埃希菌BL21中可溶性表达L1蛋白,其次采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析后,获得高纯度的的L1蛋白,再通过解聚和重聚获得VLPs。结果全基因优化并截短的HPV18L1蛋白在大肠埃希菌系统中以可溶形式表达,纯化后的蛋白纯度达到90%以上,电镜下观察到直径为60 nm的VLPs颗粒。结论利用大肠埃希菌系统可溶性表达非融合HPV18L1蛋白,并获得均一的VLPs颗粒,为疫苗的开发奠定基础。 相似文献
4.
目的构建艰难梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)毒素A羧基末端原核表达载体,优化诱导表达条件及纯化重组蛋白。方法利用聚合酶链式反应扩增C.difficile毒素A羧基末端基因序列,并将此序列转入pET-28b载体,构建pET-28b-tcdA重组表达载体,并将表达载体转化到BL21(DE3)感受态大肠埃希菌细胞中,分别在不同条件下进行诱导表达,获得最佳诱导表达条件后进行大量表达,最后用Ni柱对重组蛋白进行亲和纯化,得到纯化后的重组蛋白。结果成功构建了pET-28b-tcdA重组表达载体,其重组蛋白表达最佳诱导条件:菌液吸光度值取0.6、温度取25℃、IPTG终浓度取1.0mmol/L、诱导时间取10h。蛋白纯化咪唑磷酸盐洗脱液最佳浓度取200mmol/L。结论成功构建pET-28b-tcdA重组表达载体,在大肠埃希菌BL21(DE3)中可以有效表达,并获得高浓度重组蛋白,为进一步制备TcdA适配子奠定了一定实验室基础。 相似文献
5.
《微生物学免疫学进展》2015,(5)
目的为了在大肠埃希菌中表达具有生物学活性的小鼠IL-33成熟蛋白。方法利用PCR技术从pc DNA3.1-IL-33质粒中扩增小鼠IL-33成熟蛋白的基因,将其插入原核表达载体p ET21a(+),构建成p ET21a-m IL-33质粒,转化至大肠埃希菌BL21,筛选出可表达m IL-33的大肠埃希菌工程菌株。经IPTG诱导表达,用镍柱亲和层析法纯化。结果经SDS-PAGE分析获得纯度高达95%的m IL-33蛋白,相对分子质量18 000。ELISA试验显示m IL-33可以有效的促进肠系膜淋巴细胞产生Th2型细胞因子(IL-5),与未处理组的差异具有显著的统计学意义。结论利用大肠埃希菌表达系统表达了具有生物活性的m IL-33蛋白,为继续开展IL-33在炎症性肠病的免疫治疗研究奠定了基础。 相似文献
6.
目的 获得纯化的诺如病毒(NV)衣壳蛋白VP1,免疫动物制备多克隆抗体。方法 提取粪便样品中诺如病毒RNA,逆转录得到cDNA文库,通过PCR扩增获取VP1基因序列,构建到大肠埃希菌原核表达系统中诱导表达重组VP1蛋白。使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化,十二烷基磺酸钠‒聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝法(BSA)对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,以重组的VP1蛋白为抗原,免疫雄性SPF级SD大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价、Western blot检测抗体特异性。结果 成功地构建出重组表达载体VP1-pET28a,并将其在大肠埃希菌BL21(DE3)中稳定地表达诱导重组蛋白。ELISA测其多抗血清的平均效价为1∶200000,Western blot检测抗体在原核和真核特异性很高。结论 本实验成功地利用原核表达系统表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,为进一步研究诺如病毒的诊断和疫苗开发提供了条件。 相似文献
7.
目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体. 相似文献
8.
目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体. 相似文献
9.
目的 将阴道毛滴虫铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)基因在大肠埃希菌中诱导表达。方法制备阴道毛滴虫可溶性抗原,多点注射免疫家兔,获得的血清用ELISA测定其抗体效价。将原核表达重组质粒pET3C-Fd转化入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。结果制备出抗阴道毛滴虫多克隆抗体,抗体效价在1:8000以上,用于免疫印迹实验。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)分析,重组质粒在大肠埃希菌中表达出Fd。结论在大肠埃希菌中表达出了Fd。 相似文献
10.
目的确定人血红素加氧酶-1(human heme oxygenase-1,hHO-1)在大肠埃希菌中的表达条件与纯化方法,利用纯化的蛋白制备具有中和活性的hHO—1多克隆抗体。方法将hHO-1原核表达质粒pMW172/hHO-1转人大肠埃希菌菌株BL21,通过改变摇床转速、诱导剂IPTG浓度和培养时间确定hHO-1蛋白的最佳可溶性表达条件;利用超声破碎、高速离心、分级盐析、分子筛层析等方法纯化hHO-1蛋白,建立体外HO-1活性测定方法检测hHO-1蛋白的活性;利用纯化的hHO-1活性蛋白作为抗原免疫新西兰兔,制备多克隆抗体;利用ELISA方法和Western印迹技术分别测定抗体的效价和特异性,通过HO-1活性测定检测抗体的中和活性。结果确定hHO-1最佳可溶性表达条件为:37℃、200r/min培养3h后,0.1 mmoL/LIPTG诱导培养4h。超声破碎菌体,上清经30%~40%盐析纯化及分子筛层析纯化,获得活性hHO-1蛋白,收得率为30.3%,纯化倍数为2.83倍,纯度为90%。制备的抗hHO-1的兔血清效价达到10^6,并能中和掉46%hHO-1的催化活性。结论为hHO-1蛋白的表达和纯化以及多克隆抗体制备确立了可行的技术方案;获得了高纯度活性hHO-1蛋白及hHO-1多克隆抗体,为HO-1功能、结构研究,以及相关疾病研究奠定了基础。 相似文献