可溶性焦磷酸酶的研究进展

焦磷酸酶(pyrophosphatase, PPase)是一种将底物焦磷酸(pyrophosphoric acid, PPi)水解成两分子磷酸盐的酶。目前,自然界中存在两大类PPase:膜结合型焦磷酸酶(membrane-integral pyrophosphatase, M-PPase)和可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase, s-PPase)。s-PPase又分为Ⅰ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅠ, s-PPaseⅠ)、Ⅱ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅡ, s-PPaseⅡ)和Ⅲ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅢ, s-PPaseⅢ)。s-PPaseⅠ在不同生物中寡聚物的状态不同,s-PPaseⅡ在所有生物中都以二聚体形式存在,s-PPaseⅢ是卤代烷脱卤酶的变体。s-PPase催化PPi水解过程包括基团去活化和亲核体产生。s-PPaseⅡ中的CBS-PPase调控机制研究的比较清楚。本综述将重点对s-PPase的结构、催化特性、调控机制和应用等方面进行分析阐述,为后续深入的研究提供参考。     

自分泌运动因子-溶血磷脂酸轴的生物学功能与调控

自分泌运动因子(autotaxin,ATX)也称作磷酸二酯酶Iα,是核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族(nucleotide pyrophosphatases,NPPs)中的一员,因而也称作NPP2.ATX是NPPs中唯一具有溶血磷脂酶D(lysophospholipase D,lysoPLD)活性的成员,它可以将溶血磷脂...     

末端脱氧核苷酸转移酶在生物传感及核酸合成领域的应用*

末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)是聚合酶X家族中的一员,与典型的DNA聚合酶不同,TdT以恒温的无模板依赖的方式催化脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)聚合到寡核苷酸的3'羟基端来合成DNA。并且TdT对底物的耐受性高具有聚合修饰型dNTP的能力,如荧光修饰的dNTP、生物素修饰的dNTP,甚至人工碱基均可作为其良好底物。TdT的这些生化特性使其被广泛的应用在生物传感和核酸合成领域中,促进了许多基于核酸的工具和方法的发展,并为酶促从头合成DNA技术的发展奠定基础。介绍了TdT的性质,重点总结了它在其介导的生物检测技术、核酸的修饰技术以及酶促合成DNA技术三个方面的核心作用、目前面临的挑战以及未来研究的方向,以期促进TdT在生物传感器和核酸合成中的进一步应用。     

植物焦磷酸酶(PPase)的研究进展

植物焦磷酸酶(PPase)可分为存在于细胞质中可溶性的无机焦磷酸酶和与膜结合的不可溶性焦磷酸酶.后者不仅能水解焦磷酸,同时还具有质子泵的功能.橡胶树乳管中与黄色体膜结合的不可溶性焦磷酸酶,是调控橡胶生物合成的一个必不可少的酶.对植物焦磷酸酶的结构及其功能和分子生物学研究的进展进行了综合论述,并着重阐述了焦磷酸酶在橡胶树橡胶生物合成中的作用.     

大肠杆菌中依赖于DNA的RNA聚合酶的提取

在细菌和其他动植物细胞中都普遍存在着一种以DNA作为模板,利用四种核糖核苷三磷酸作为底物来合成RNA的酶,这种酶叫做依赖于DNA的RNA聚合酶[E.C.2.7.7.6]。从细菌中提取这种酶的方法不少,但以Cham-berlin和Berg以及Burgess的方法使用最为普遍。我们主要参照Burgess氏的方法以大肠杆菌K12(E.coli K 12)中提取RNA聚合酶,并稍加改变。     

人细胞核dUTPase的克隆表达及其酶学活性

以阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者脑cDNA文库质粒为模板 ,用PCR方法扩增得到人细胞核dUTP焦磷酸酶 (dUTPase)的cDNA ,将其克隆到谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 4T 1中 ,并在大肠杆菌BL2 1中获得高效表达 .表达的融合蛋白GST dUTPase经过谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,凝血酶酶切和SephacrylS 10 0纯化 ,得到高纯度dUTPase蛋白 .通过SDS PAGE ,氨基酸组成分析 ,N端氨基酸序列测定以及HPLC测Mr 结果与期望值一致 .通过检测该酶水解dUTP释放的焦磷酸 (PPi)来测定表达产物dUTPase蛋白及GST dUTPase融合蛋白的酶活性 ,发现两蛋白都具有正常的酶水解dUTP活性 ,但融合蛋白的活性比dUTPase蛋白低 7～ 8倍 .同时研究了Mg2 +和EDTA对酶活性的影响     

RNA的生物合成与加工(一)

所有细胞的RNA都是按照DNA模板的指令,由RNA聚合酶催化合成的。RNA的生物合成(转录)过程的有些地方与DNA复制相似,如底物是核苷三磷酸,合成方向是5′→3′。但,RNA聚合酶不需要引物,也不具备有校正作用的核酸外切酶活力。DNA模板在RNA合成中是全保留的,而在DNA复制中则是半保留的。原核生物的转录原核生物转录的源料主要是从大肠杆菌取得的。大肠杆菌的所有RNA都是由同一种RNA聚合酶催化合成的。这种酶的分子量为460KDa,全酶的亚基组成为α_2ββ′σ,核心酶为α_2ββ′。σ亚基只在转录的启动中起作用,     

利用固定化啤酒酵母合成5'-核苷三磷酸

固定化啤酒酵母细胞由5’-核苷一磷酸(NMPs)合成5’-核苷三磷酸(NTPs)。在250mL摇瓶中加入20g固定化酵母细胞和20mL反应液(NMP 40mmol/L,葡萄糖150mmol/L,K2HPO4-KH2PO4缓冲液250 mmol/L,硫酸镁10mmol/L),pH 7.0,35℃,反应2.5h,NTP转化率达到80%。底物溶液添加NAD 后,该固定化酵母细胞可反复使用10次,NTP的转化率稳定维持在70%以上。     

六磷酸肌醇激酶(IP6Ks)的生物学功能及其在疾病中的作用

可溶性和脂质状态的磷酸肌醇在真核细胞中广泛存在,它们在细胞的发育和生物学功能中起到重要作用。其中,六磷酸肌醇激酶(inositol hexaphosphate kinases,IP6Ks)是焦磷酸肌醇合成的限速酶,它可以在肌醇环第一位、第三位或第五位已有的磷酸基团上再加一个磷酸基团合成焦磷酸肌醇,例如5-焦磷酸–五磷酸肌醇(5-pyrophosphate inositol pentaphosphate,IP_7、PP-IP_5)和1,3-二焦磷酸肌醇–四磷酸(bis-diphosphoinositol tetrakisphosphate,IP_8、[PP]_2-IP_4)。IP6Ks通过以上过程在DNA修复、染色体重组、细胞死亡、凝血作用、造血调控、免疫调控、癌症进展等方面发挥作用,因而受到越来越多的重视。该文基于近期IP6Ks的相关研究进展,就IP6Ks在细胞功能调控以及疾病治疗中的作用作一综述。     

病毒dUTPase研究进展

脱氧尿苷焦磷酸酶（dUTP pyrophosphatase,dUTPasc）广泛存在于真核、原核细胞和病毒等生物有机体中,通过催化水解脱氧尿苷三磷酸（dUTP）,减少尿嘧啶在DNA合成中的错误掺入,降低细胞中的dUTP／dTTP比例,保证DNA复制的正确性和顺利进行。病毒编码的dUTPasc具有种属特异性,且与病毒的毒力和高效复制密切相关。本文就dUTPase的生物学功能、分类特征、表达调控、分布定位及病毒dUTPase功能的研究进展进行了概述,为深入开展dUTPase功能研究提供理论基础。     

焦磷酸在植物细胞能量代谢中的作用(综述)

ADVANCESINRESEARCHONTHEROLESOFPYROPHOSPHATEINCELLULARENERGYMETABOLISMOFPLANTSWangYixing(DepartmentofBiology,JinanUniversity,Guangzhou510632)LiMingqi(DepartmentofAgriculturalBiology,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642)焦磷酸（PPi）是一种高能化合物,其水解的G为-33．4kJmol,即PPi水解释放的自由能与ATP相似（ATP水解为ADP和Pi的G为-31．3kJmol）。但是对于焦磷酸代谢的传统观点是：细胞内焦磷酸水平很低,代谢中的焦磷酸,主要是在大分子如蛋白质、淀粉等生…     

耐热荧光素酶的表达及热稳定焦磷酸测序体系的建立

焦磷酸测序是一种基于生物发光反应的实时DNA序列测定技术,其反应体系中的荧光素酶决定测序反应的灵敏度。传统焦测序反应使用的是野生型北美荧光素酶Photinus pyralis luciferase(PpL),该酶热稳定性较差,因此由该酶配制的焦磷酸测序反应体系对热不稳定,影响焦磷酸测序的灵敏度。为了建立热稳定的焦磷酸测序反应体系,全合成了耐热突变日本萤火虫荧光素酶的编码序列,并将其插入到表达载体pET28a(+)中构建重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌中,筛选得到的阳性重组菌成功表达了N端带有6×His(组氨酸)标签的耐热突变日本萤火虫荧光素酶。利用镍亲和层析法,纯化得到了分子量约为60 kDa且比活为4.29×1010RLU/mg的重组蛋白。对重组耐热日本萤火虫荧光素酶的热稳定性研究结果表明,该酶在50℃时仍具有活性,在40℃下孵育25 min后活性保留了90%以上。与基于野生型北美荧光素酶的焦磷酸测序体系相比,由耐热日本萤火虫荧光素酶配制的测序反应体系对热稳定性有了极大的提高,该测序反应液在37℃放置1 h后仍能够得到正确的测序结果。研究结果为建立稳定可靠的现场及时快速焦磷酸测序反应体系奠定了基础。     

焦磷酸光化测序技术的发展和应用

人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平,而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。正是在这样的历史背景下,焦磷酸光化测序技术(pyrosequencing)由瑞典研究人员发明。焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于"通过合成测序"原理进行酶促反应的DNA测序方法,通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测,即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定,以及DNA甲基化水平变化的分析等。近年来,随着摄影器材和成像技术的快速发展,这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光,因此,有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献,首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理,然后介绍该技术的应用,最后讨论其发展前景。     

细胞dNTP库的稳态维持与基因组稳定性

作为DNA合成的重要前体,细胞中4种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)是DNA复制、重组和修复所必需的原材料,而DNA的正确合成及其完整性则是基因组稳定性的重要体现,因此dNTP库状态的稳定对维持基因组的稳定进而保证细胞的稳定至关重要.从dNTP库的质量上讲,一些异质dNTP如氧化的dNTP掺...     

基于NADH焦磷酸酶高效表达的NMNH生物转化合成

辅酶I (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺)作为人体内重要的辅酶,在维持细胞生长、分化和能量代谢以及细胞保护方面起着重要作用。还原型烟酰胺单核苷酸(reduced nicotinamide mononucleotide, NMNH)是一种有效的NAD+增强剂,可以快速、高效地提高组织中NAD⁺水平。NADH焦磷酸酶可将还原型辅酶I (reduced nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)转化为NMNH以促进NAD⁺的再生。【目的】在枯草芽孢杆菌中构建NADH焦磷酸酶表达体系并实现NMNH的生物转化合成。【方法】通过载体筛选成功在枯草芽孢杆菌WB600中实现NADH焦磷酸酶的胞内表达,结合启动子工程提升其酶活,同时通过培养基优化及5 L发酵罐放大发酵策略进一步考察重组酶的工业应用潜力。在此基础上采用全细胞催化体系进行NMNH的生物转化。【结果】NADH焦磷酸酶的初始表达酶活为1.70 U/mL,NMNH产量为135 mg/L。通过启动子工程化改造,将酶活提升了41%;此外,培养基优化及5 L发酵罐放大发酵策略将酶活进一步提升至5.02 U/mL,较摇瓶水平提升1.09倍;在此基础上采用全细胞催化体系进行NMNH生物转化,获得NMNH产量为1.20 g/L,较初始产量提高了7.88倍。【结论】本研究开发了NADH焦磷酸酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达体系,并采用全细胞催化方式实现了NADH到NMNH的高效转化,为NMNH的生物合成提供了新思路。     

谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶研究进展

谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶是生物．体内嘌呤产物合成途径的关键酶,负责催化全合成途径的第一步反应。肌苷属于嘌呤核苷,是食品和医药行业广泛应用的重要产品。谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶在肌苷的生物合成途径中起重要调节作用,对其深入研究将有助于提高肌苷的产量,对工业化生产有重大意义。本从谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶的属性、功能、结构和基因表达与调控方面对其做了介绍,为肌苷产量的提高工作奠定了基础。     

RNA聚合酶维持转录忠实性的机制

RNA聚合酶(RNAP)在维持转录忠实性方面具有重要的作用,其忠实性机制可以分为特异性的底物选择和校对2种.RNAP高水平的底物选择忠实性主要基于碱基配对和诱导契合机制,而校对功能则通过焦磷酸解和RNAP内在的RNA剪切活性完成.现在,RNAP的研究已经超出了其在转录中的作用,延伸到了其他领域.本文主要论述了RNAP忠实性机制的研究进展,并将之与DNA聚合酶、氨酰-tRNA合成酶及核糖体的忠实性机制进行了比较.最后,论述了RNAP在新药或新药靶点开发中的作用,并对其应用前景进行了展望.     

噬菌体Z基因组生物合成通路的研究进展

噬菌体基因组中存在丰富的碱基修饰，主要用于逃避宿主内切酶的切割。40多年前，在蓝藻噬菌体S-2L的DNA中，研究者发现2-氨基腺嘌呤(Z)完全取代腺嘌呤(A)，与胸腺嘧啶(T)形成具有三根氢键的互补配对，形成了特殊的Z基因组。近年来，研究者在多个噬菌体中发现并证实了噬菌体Z基因组生物合成通路。该通路是一个多酶系统，其中包含由噬菌体DNA编码的2-氨基脱氧腺苷琥珀酸合成酶(PurZ)、脱氧腺苷三磷酸水解酶(dATPase/DatZ)、脱氧腺苷/脱氧鸟苷三磷酸的焦磷酸水解酶(DUF550/MazZ)和DNA聚合酶(DpoZ)。本文在简述噬菌体中各种修饰核苷发现历史的基础上，详细介绍了Z基因组生物合成通路中多种酶的研究进展，最后对Z基因组及其合成通路中多种酶的应用进行了展望，以期为该领域的研究提供借鉴和参考。     

AtCPS V326M突变显著影响赤霉素合成

赤霉素(gibberellins,GA)是植物激素之一,调控植物生长和发育.植物体中赤霉素合成量直接影响植物的形态和生物量.在赤霉素合成途径中,柯巴基焦磷酸合酶基因(copalyl diphosphate synthase,CPS)是第一个合酶基因,该基因突变会严重影响赤霉素合成量.本研究通过对根和下胚轴缩短、晚花、丛...     

代谢工程改造酿酒酵母生产β-胡萝卜素

β-胡萝卜素在食品、药品和化妆品领域有广泛用途。为获得生产β-胡萝卜素的微生物细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母BY4742中过表达甲羟戊酸(MVA)途径的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因及二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)基因,来提高牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的供给。在酿酒酵母底盘菌BY4742-T2的基础上整合来源于成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素合成基因,比较酿酒酵母工程菌生产β-胡萝卜素的差别。结果表明提高酿酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表达能将工程菌中β-胡萝卜素的产量提高26.0倍。另外,来源于真核生物红法夫酵母的合成基因相比成团泛菌,更有利于酿酒酵母生产β-胡萝卜素。最终获得的酿酒酵母工程菌BW02能生产1.56 mg/g细胞干重的β-胡萝卜素,为进一步获得高产β-胡萝卜素细胞工厂提供基础。