携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(ESbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此ESbla的活性.携带此ESbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的ESbla.     

携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(ESbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此ESbla的活性.携带此ESbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的ESbla.     

携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(Esbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此Esbla的活性.携带此Esbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的Esbla.     

大肠杆菌质粒突变体(p#GTES)的特性分析

大肠杆菌(E.coli)RRI质粒(pGTE5)的β-内酰胺酶基因(β-lactamas gene)可以在E. coli与枯草杆菌(Bacillus subtilis)中复制和表达。但是,在E. coli细胞中向胞外分泌β-内酰胺酶量少,活力低,对氨苄青霉素(Ampicillin,简称Ap)的抗性也低。将该菌株用紫外线(30w,40cm,150s)和硫酸二乙酯双重诱变,在含Ap的LB平板上筛选到已．Coli质粒突变体(p#GTE5)。     

地衣芽孢杆菌的β－内酰胺酶基因的克隆与穿梭质粒的建造

本文简要报道了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)染色体上的β-内酰胺酶基因的克隆化,及以此基因为基础建造了一批能在大肠杆菌(E．Coli)和枯草杆菌(Bacillus sub-tillis)中都起作用的穿梭质粒的实验。该β－内酰胺酶基因在枯草杆菌中产生大量产物并可分泌到细胞外。     

TEM-1型β内酰胺酶的原核表达纯化及活性验证

目的:产β-内酰胺酶是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等对β内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一,该酶能水解青霉素、头孢菌素、碳青酶烯类等多种抗生素,其中TEM型是发现最早且种类最多的β内酰胺酶。探讨TEM-1型β内酰胺酶原核表达载体的构建、酶的纯化及活性验证。方法:利用PCR技术,以大肠杆菌全基因组为模板钓取TEM-1基因,构建p ET22b(+)-TEM-1表达质粒,经测序鉴定后,转入大肠杆菌Transetta(DE3),IPTG诱导表达、亲和纯化,并通过抗生素水解实验验证其酶活性。结果:构建了可溶性表达TEM-1的工程菌,通过亲和纯化最终获得纯度达90%以上的TEM-1型β内酰胺酶,该酶可水解氨苄西林。结论:获得了对氨苄西林具有水解活性的TEM-1型β内酰胺酶,并对其进行了酶动力学参数检测,验证其抗生素水解特性,有利于对临床抗生素的合理应用做出指导。     

大肠杆菌中一种新类型的超广谱β-内酰胺酶

出现于北京协和医院的一耐头孢噻甲羧肟的临床分离菌株大肠杆菌(E.coli 5518),含有一约7.5kb的耐药质粒,编码产生一种新类型的超广谱β-内酰胺酶(Esbla).除了头霉甲氧噻吩和亚胺硫霉素外,产酶菌株对所测定的多种β-内酰胺类药物都耐药.该菌株耐β-内酰胺类药物的特性可接合传递给E.coli JP559菌株,与之一起转移的还有耐氨基糖甙类和磺胺类药物的特性.β-内酰胺酶抑制剂棒酸能抑制此酶的活性.此Esbla基因既不与SHV-1也不与TEM-1的结构基因片段杂交.     

宋内志贺氏菌1173质粒基因组及耐药基因转移机制

【目的】研究质粒介导宋内志贺氏菌1173耐药基因bla_(CTX-M-64)转移的机制。【方法】用双纸片协同扩散法验证1173是否产超广谱β-内酰胺酶(ESBL),用PCR扩增鉴定其携带的耐药基因,接合转移实验检验其耐药质粒是否可通过接合转移给其他细菌,并对接合子是否产ESBL和携带耐药基因进行检验,利用VITEK~?2检测1173和接合子的耐药谱,提取质粒进行高通量基因组测序,并对质粒序列进行生物信息学分析,以研究其耐药基因转移机制。【结果】1173是产ESBL的多药耐药宋内志贺氏菌,携带的耐药基因有bla _(CTX-M-64)和bla _(TEM),其中的bla _(CTX-M-64)可通过接合转移作用传递给受体菌EC600,并使接合子具有相应的耐药谱。经序列测定和生物信息学分析表明,介导bla _(CTX-M-64)水平转移的是ISEcp1-bla_(CTX-M-64)-Δorf477转座单元。【结论】质粒携带的bla_(CTX-M-64)介导1173对多类抗菌药物的耐药,ISEcp1-bla_(CTX-M-64)-Δorf477转座单元介导bla_(CTX-M-64)在细菌间的转移。     

大肠杆菌中一种新类型的超广谱β—内酰胺酶

出现于北京协和医院的一耐头孢噻甲羧肟的临床分离菌株大肠杆菌(E.coli 5518),含有一约7.5kb的耐药质粒,编码产生一种新类型的超广谱β-内酰胺酶(ESbla).除了头霉甲氧噻吩和亚胺硫霉素外,产酶菌株对所测定的多种β-内酰胺类药物都耐药.该菌株耐β-内酰胺类药物的特性可接合传递给E.coli JP559菌株,与之一起转移的还有耐氨基糖甙类和磺胺类药物的特性.β-内酰胺酶抑制剂棒酸能抑制此酶的活性.此ESbla基因既不与SHV-1也不与TEM-1的结构基因片段杂交.     

碱性β-甘露聚糖酶基因异源表达的研究

亚克隆的碱性β-甘露聚糖酶基因(man)来源于嗜碱芽孢杆菌N16-5,构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌诱导型表达质粒pDG-man,在大肠杆菌JM109中获得了活性表达,经0.5 mmol/L的IPTG诱导后,可表达5 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。重组大肠杆菌DE3-RIL(pDG-man)表达β-甘露聚糖酶水平是大肠杆菌JM109(pDG-man)的2倍。重组枯草芽孢杆菌WB600(pDG-man)可表达19.2 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌相关耐药基因的检测

目的对耐亚胺培南（IMP）的铜绿假单胞菌（IRPa）相关耐药基因进行检测。方法 2003年至2009年从临床标本中分离到（P.aeruginosa）共220株,采用三维试验筛选产β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌,应用普通PCR和多重PCR分别检测碳青霉烯酶基因和质粒携带的C类头孢菌素酶（AmpC酶）耐药基因,应用荧光定量RT-PCR的方法检测oprD2基因的表达情况。结果共检出43株产β-内酰胺酶的菌株,其中产AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、金属β-内酰胺酶（MBLs）和未知酶菌株的构成比分别58.14%（25/43）、18.60%（8/43）、4.65%（2/43）和16.28%（7/43）。74株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中,有2株菌携带IMP-9基因,1株菌携带DHA质粒型AmpC酶基因,其他碳青霉烯酶基因检测为阴性。40株菌株oprD2基因表达蛋白量降低,34株oprD2基因表达蛋白量正常。结论 oprD2基因的突变或蛋白表达量降低是IRPa对亚胺培南耐药的主要原因,AmpC酶可水解亚胺培南可能与铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药有一定的关系,而KPC-1酶和MBLs在铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制中不是主要因素。     

泛耐药基因NDM-1在大肠杆菌中的克隆表达及耐药性检测

目的:构建bla(NDM-1)基因重组质粒,表达新德里金属β内酰胺酶1(NDM-1),并检测携带bla(NDM-1)基因重组质粒的大肠杆菌的耐药状况。方法:PCR扩增编码NDM-1的基因bla(NDM-1),构建表达载体pGEX4T-1-NDM-1,并转化至大肠杆菌,转化子经PCR后测序,以确认构建和转化成功;用Western印迹验证重组蛋白的表达;用药敏纸片法检测含重组质粒pGEX4T-1-NDM-1的大肠杆菌的耐药谱;用E-test法测定其最低抑菌浓度(MIC)。结果:PCR及测序结果显示载体构建和转化成功;含重组质粒pGEX4T-1-NDM-1的大肠杆菌在37℃时,经1 mmol/LIPTG诱导5 h后,SDS-PAGE可见目的条带;除对替加环素和粘菌素敏感外,该重组子对多种碳青霉烯类抗生素耐药,E-test检测其对亚胺培南的MIC为64μg/mL。结论:构建了含泛耐药基因bla(NDM-1)的重组质粒,转入大肠杆菌后表达了融合蛋白,并对多种碳青霉烯类抗生素耐药。为进一步研究bla(NDM-1)基因和蛋白的功能奠定了基础。     

β-内酰胺酶TEM和SHV族

TEM和SHV族β-内酰胺酶(包括广谱β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶和耐酶抑制剂β-内酰胺酶)是肠杆菌科细菌耐药的主要机制,不同氨基酸位点突变引起不同耐药性的改变.本文对其作用机制、分子结构及演变过程作了综述,以指导抗生素在临床上的合理应用.     

质粒AmpC β-内酰胺酶及其多重聚合酶链反应检测

质粒AmpC酶属Bush I型β—内酰胺酶,可分为6个不同的群(ACC、FOX、MOX、DHA、CIT和EBC)。Perez和Nancy等设计用6组特异性AmpC引物的多重聚合酶链反应来检测质粒ampC基因,一次聚合酶链反应即可分析多个ampC基因,并能排除诱导型AmpC β—内酰胺酶干扰,还可进行多重耐药机制的检测和多重AmpC β—内酰胺酶的鉴别,对细菌耐药性监测和流行病学的研究有重要意义。     

IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pBTR-CTXM的结构基因组学分析

【背景】IncFII-FIA-FIB型质粒广泛存在于肠杆菌科细菌中,介导了许多耐药基因的水平转移,并导致细菌多重耐药问题日益严重。【目的】分析IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pBTR-CTXM的基因组结构,并研究其介导大肠杆菌BTR株的耐药基因水平转移机制。【方法】利用PCR进行耐药基因筛查;接合转移和电转化实验验证质粒pBTR-CTXM是否具备自主接合转移的特性;VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪测定相关菌株对抗生素的药物敏感性;构建MatePair文库并进行细菌全基因组高通量测序和质粒结构基因组学分析。【结果】菌株BTR是携带blaNDM-1、blaCTX-M-15、blaTEM、qnrD、qnrS1、mph(A)、erm(B)和tetA(B)等耐药基因的多重耐药大肠杆菌,其中blaCTX-M-15、mph(A)、erm(B)和tet A(B)等耐药基因均位于大小为144 939 bp的质粒p BTR-CTXM (GenBank登录号MF156697)上,该质粒可与菌株BTR内质粒pNDM-BTR接合共转移到受体菌大肠杆菌EC600中。pBTR-CTXM具备IncFII-FIA-FIB型质粒典型的骨架区结构,其多重耐药(Multidrug-resistant,MDR)区由新的复合型转座子Tn6492、Tn2残余、Tn10残余、ISEcp1-blaCTX-M-15-Δorf477转座单元和一些插入序列组成。【结论】pBTR-CTXM中新复合型转座子Tn6492与Tn10残余和ISEcp1-blaCTX-M-15-Δorf477转座单元共同介导大肠杆菌BTR株的多重耐药与耐药基因的水平传播。     

细菌抗药质粒中抗性基因的转座作用

ER275、ER396(Tc~r、Ap~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)与DR233、DR416(Tc~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)是来自临床的抗药质粒。当带有这些质粒的菌株分别与大肠杆菌J5-3/R144drd3(Km~r)配对时,组成了两种质粒共存的菌株。用这种质粒共存的菌株作为接合转移的给体,并以Ap或Sm作为选择药物,得到ApKm或SmSuKm抗性类型的转移接合子,此种转移接合子能将ApKm或SmSuKm抗性作为一个单位连锁地转移到受体菌株,而且转移频率与R144drd3相似。 生化的研究表明,ER275、ER396质粒中的Ap抗性基因编码β-内酰胺酶,DR233与DR416质粒中的Sm抗性基因编码链霉素钝化酶,而带有Ap Km或Sm Su Km重组质粒的转移接合子也分别具有了合成这二种酶的能力。因此我们推测在ER275、ER396与DR233、DR416质粒中分别有可转座的Ap抗性基因与可转座的SmSu抗性基因存在。     

人胰岛素基因的合成Ⅷ.表达型质粒的构建和在大肠杆菌内生产含胰岛素原的融合蛋白

我们已构建两组质粒,适合于在大肠杆菌内克隆基因和直接大量咸融合蛋白。这些质粒含有E.coli的lac启动基因和部分编码β-半乳糖苷酶的序列,编厔的蛋白长度约590或450个氨基酸殖基(原基因编码1023个氨基酸殖基)。被缩短的β-半乳糖苷酶基因的末端跟随一个多种限制性酶的接头序列;这个序列可被八种限制性酶中的任一种切断,然后插入任何蛋白基因。每组质粒有三种,可以满足所有三种不同的翻译读框。我们克隆了人工合成的入胰岛素原基因到这些质粒上去,在大肠杜菌内可以生产大量β-半乳糖苷酶残基—人胰岛素原融合蛋白。     

细菌间bla_(NDM-1)传播规律的研究进展

新德里金属β-内酰胺酶-1 (New Delhi metallo-β-lactamase 1,NDM-1)导致革兰氏阴性细菌对几乎所有的β-内酰胺类抗生素(β-lactam antibiotic)产生抗性。携带NDM-1编码基因(bla_(NDM-1))的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和不动杆菌属(Acinetobacterspp.)细菌在世界各地广泛流行,严重威胁着公共健康。现对NDM-1的结构、突变亚型和传播规律进行综述,为预防和控制NDM-1携带菌提供策略。     

超广谱β-内酰胺酶CTX-M-14中药抑制剂的筛选及芸香苷抑酶作用研究

β-内酰胺酶的产生是细菌产生耐药的常见机制,其主要代表为超广谱β-内酰胺酶,其中CTX-M-14在全世界呈现流行趋势,为寻找一种CTX-M-14抑制剂,使细菌恢复对β-内酰胺类抗生素的敏感性,本试验首先构建了CTX-M-14的原核表达载体,并以CTX-M-14为靶点借助虚拟筛选工具Autodock Vina进行筛选,得到结合作用较好的中药单体抑制剂芸香苷,通过DS Visualizer分析其相关作用力;通过联合抑菌试验验证芸香苷与抗生素的联合抑菌作用;通过酶动力学试验比较抑酶剂芸香苷与克拉维酸的抑酶作用与方式。结果表明,芸香苷与超广谱β-内酰胺酶CTX-M-14结合部位形成多个氢键和范德华力,其结合作用力为9.9 kcal/mol;芸香苷与头孢噻肟钠对大肠杆菌E320呈协同作用(FICI=0.236);0.312 5 mg/mL的芸香苷与头孢噻肟钠对CTX-M-14蛋白阳性重组菌呈协同作用(FICI≤0.375);1.25 mg/mL的芸香苷与头孢噻肟钠对导入空质粒pET-28a(+)的BL-21呈无关作用(FICI=1.5);抑酶剂芸香苷与克拉维酸均为竞争性抑制剂,但克拉维酸抑酶作用...     

超广谱β-内酰胺酶SHV-18的表达纯化及活性验证

目的：产超广谱β-内酰胺酶是肠杆菌科细菌和肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶类抗生素耐药的重要机制,该类酶主要水解青霉素类、头孢菌素类以及单环酰胺类抗生素。自从1983年第-次有关p内酰胺酶的报道开始,至今已经发现超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的种类超过400种,其中SHV型是最常见的ESBLs类型之一。本研究主要探讨了超广谱β-内酰胺酶SHV－18的原核表达载体的构建、酶的纯化和活性验证。方法：利用肺炎克雷伯菌ATCC700603全基因组为模板,应用分子生物学技术钓取SHV-18基因,构建pET22b（＋）-SHV－18表达质粒,经测序鉴定后,转化大肠杆菌Transetta（DE3）,IPTG诱导表达并亲和纯化,进-步通过抗生素水解实验,检测其水解活性,测定其酶动力学参数。结果：成功构建了可以以裂解上清形式高效表达SHV-18的工程菌。通过亲和纯化最终获得纯度达到90％以上的β-内酰胺酶SI-IV-18。获得的SHV-18蛋白能够水解青霉素G、头孢拉定、头孢唑肟、头孢他啶、头孢吡肟等多个抗生素。结论：获得了对青霉素和头孢菌素类具有水解活性的超广谱β-内酰胺酶SHV-18,并对其酶动力学参数进行了检测。在实验室研究了β－内酰胺酶SHV－18对不同抗生素的水解特性,更加有利与指导临床抗生素的合理使用。