细胞周期蛋白和细胞周期

细胞周期是当前细胞生物学和分子生物学的热门研究课题之一。细胞生物学家、分子生物学家和遗传学家们运用了不同的材料对细胞周期G_1→S、S→G_2、G_2→M和M→G_1等过渡的调控问题进行了研究,其中以周期蛋白和p34~(cdc2)相互作用的研究最为引人注目。在G_2→M过渡期,p34~(cdc2)和周期蛋白B结合,经历一系列的磷酸化和去磷酸化过程,形成有活性的MPF,实现G_2→M期的过渡,在M期中/后期,周期蛋白B降解,致使MPF失活,细胞离开M期;在G_1→S期过渡时,p34~(cdc2)和G_1周期蛋白结合,引起DNA的复制,使细胞进入S期。此外还发现不少cdc 2的类似物在细胞周期各过渡期也有作用。因此,不同的周期蛋白和不同的cdc 2产物,参与细胞周期的方式不同。细胞周期的调控是多途径的和多层次的,这已成为进一步揭示细胞周期调控活动所必需研究的问题。     

滑动序列对游仆虫中识别+1位和+2位编程性核糖体移码具有关键作用

编程性核糖体移码(programmed ribosomal frameshifting,PRF)广泛存在于生命进化谱系的各个分支,是一种翻译水平上的基因表达调控方式。单细胞真核生物游仆虫(Euplotes)中不仅PRF基因比例高,而且移码类型有+1和+2位两种。本研究从基因组水平对八肋游仆虫(E.octocarinatus)中的+2 PRF基因进行了鉴定,比较分析+1及+2 PRF基因中可能的调控元件。为了探讨游仆虫中滑动序列对移码类型的影响,克隆了八肋游仆虫的+1 PRF基因——η微管蛋白基因,将其构建到含绿色荧光蛋白报告基因的游仆虫大核人工染色体中,转染游仆虫细胞,通过检测GFP的表达来确定不同滑动序列突变体对应的移码类型。结果表明,滑动序列的改变能使游仆虫+1 PRF转变为+2 PRF,且这种移码类型的改变与滑动序列第1个密码子编码何种氨基酸无关。本研究揭示了滑动序列对游仆虫中识别+1和+2位的编程性核糖体移码具有关键作用。     

游仆目纤毛虫(纤毛门,旋唇纲)的分子系统学研究

在最新GenBank分子信息的汇集、分析基础上,利用小亚基单位核糖体RNA基因序列分别构建了最大简约树、距离树、最大似然树及贝叶斯树,对长期存在争议的游仆目纤毛虫的系统关系进行了探讨和修订.工作显示:1)游仆目不是1个单源发生系;2)盘头虫类从游仆目中较早分化出来,呈现与排毛类、寡毛类平行的进化关系;3)腹棘虫科内的腹棘虫和拟游仆虫体现了密切的亲缘关系;4)游仆虫科、舍太虫科、檐纤虫科在所有分子树中均表现了十分稳定的拓扑结构;5)游仆虫属内可以细分为7个亚类群;6)尾刺虫科在游仆目内分化较早,支持前人有关其在系统演化时序中处于原始阶段的论断.     

高等真核细胞蛋白质磷酸化与细胞周期G1向S期过渡的调控

真核生物细胞周期运行涉及三个时期过渡(Phase transitions)的调控;1.G_0向G_1期过渡,2.G_1向S期过渡,3.G_2向M期过渡等的调控。近年来,对调控G_1向S期过渡的生化事件的研究结果表明,转录和转录后水平上的调控机制在其中起重要作用。通过磷酸化与去磷酸化而参与G_1向S期过渡调节的蛋白主要有:pRB(retinoblastoma gene product,视网膜母细胞瘤基因蛋白),p107(pRB related pro-tein,pRB相关蛋白),p53,RPA(replicati一     

染色体端粒DNA与核骨架的结合关系(简报)

端粒是真核生物染色体的一种特化结构,对于染色体的稳定以及染色体的完全复制有着十分重要的意义。许多种生物的端粒DNA序列已被发现:四膜虫,草履虫为(G_4T_2)_n;人、锥虫、短膜虫为(AG_3T_2)_n;尖毛虫、棘尾虫、游仆虫为(T_4G_4)_n;拟蓝芥菜为(AG_3T_3)_n。     

钙调素对细胞周期的调节

RC3细胞是一种用真核表达载体1~(CaM)转染NIH 3T3细胞建成的可调钙凋素(Calmodulin,CaM)高表达细胞模型。通过分子杂交及蛋白免疫印迹方法证实在地塞米松(Dexamethasome,DXM)作用下,RC3细胞可高表达CaM。CaM的过表达使G_1期细胞减少,S期细胞增加;CaM拮抗剂三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)则使G_1期细胞增加,S期细胞减少。高表达CaM使细胞分裂指数提高,G_2期细胞减少,有丝分裂前期细胞增加,M中期细胞比例下降。而TFP处理则使分裂指数下降,G_2期细胞增加,M前期细胞减少,M中期细胞增加。实验结果表明CaM在G_1/S、G_2/M和M中期/M后期3个位点上对细胞周期进行调控;通过加速G_1至S期,G_2至M期和M中期至M后期的进程,使细胞倍增时间缩短,促进细胞增殖。本工作表明,RC3细胞作为CaM表达可调细胞模型,是研究细胞周期调控的有力工具。     

八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1有2个亚型

真核生物酸性核糖体磷酸化蛋白(P0、P1、P2)位于核糖体60S大亚基上,它们在核糖体上共同组成一个向外侧凸出的五聚体的柄状复合物［P0·(P1·P2)2］,该复合物在蛋白质合成延伸过程中起着重要作用．为了探讨单细胞真核生物核糖体柄状复合物的组成形式及在蛋白质合成中的作用,对八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）的P1进行了研究．通过生物信息学方法,分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,找到2个酸性核糖体蛋白P1基因,从DNA 和cDNA中都扩增到这2个P1基因,表明八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1确实存在2个亚型. 将2个基因克隆后分别构建重组表达质粒pET28a-P1A和pGEX-6P-1-P1B,在大肠杆菌BL21中获得高效表达.经镍柱和GST柱亲和层析后,获得较高纯度的八肋游仆虫酸性核糖体蛋白EoP1A和EoP1B,表达产物经Western印迹检测为阳性．Pull-down分析了EoP1A和EoP1B之间的相互作用．结果表明,游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1的2个亚型EoP1A和EoP1B之间存在相互作用.     

B7-2胚胎性癌细胞与其分化细胞的周期特性

本文用~3H-thymidine标记B7-2EC细胞及其经HMBA诱导的分化细胞。根据连续标记和脉冲标记核百分率,计算和分析这两种细胞的细胞周期各时相特点。结果表明,未分化EC细胞的周期是18小时,其中G_1期1.7小时,S期13.6小时;分化细胞的周期是30小时,G_1期8.6小时,S期17.1小时。因此,B7-2分化细胞与未分化的相比,主要是G_1期和S期时相相应拉长。     

小腔游仆虫形态学、个体发育与分子系统学研究

游仆类是纤毛虫中进化最为复杂和高等的一大类群,为了进一步探索和完善游仆类的多样性,本研究利用活体观察、蛋白银和银浸法染色技术对采自青岛小西湖的小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)的形态学及细胞发生学进行了详尽的研究,并在完整的形态学及发生学研究基础上,测定了小腔游仆虫的核糖体小亚基基因(SSU r DNA)序列,通过序列比较和分子系统树构建等方法,对小腔游仆虫的系统地位进行了分析。结果表明:本种鉴别特征为9根额腹棘毛,5根横棘毛,2根缘棘毛,2根尾棘毛,8列背触毛,double-eurystomus型银线系。发生学特征包括:(1)后仔虫口原基在表皮下独立发生,前仔虫完全继承老口围带;(2)额–腹–横棘毛原基从左向右按照3:3:3:2:2的模式形成额腹棘毛和横棘毛;(3)前后仔虫最左侧额腹棘毛分别由独立产生的原基形成;(4)缘棘毛原基独立发生;(5)初级背触毛原基来自虫体中部老结构的反分化;(6)前后仔虫尾棘毛分别来自最右侧2列背触毛原基和老背触毛列末端;这些特征显示出游仆虫属个体发生模式的高度保守性。分子系统分析与形态学数据一致,即游仆虫属为单元发生,且小腔游仆虫与艾美游仆虫(Euplotes amieti)、阔口游仆虫(E.eurystomus)和伍氏游仆虫(E.woodruffi)聚在一起。     

用双参数流式细胞光度术(FCM)研究阿克拉霉素对L_(1210)白血病细胞周期的影响

本文用双参数FCM技术,对同一个细胞的DNA和RNA含量进行相关测量,比较了ACM B对小鼠L_(1210)白血病细胞周期和RNA含量的影响.结果发现在一次给药后8小时可导致早、中期S的积累,并抑制S期细胞的DNA合成;到24小时DNA合成恢复正常,并进入G_2期,但由于G_2期细胞进入M期受阻,造成G_2期细胞的积累,这时被阻断在G_2期的细胞RNA含量显著增加,形成正不平衡生长,而给药剂量较大的实验组(1/1.5LD_(50))S期细胞的RNA含量不随着DNA含量的增加而增加,形成负不平衡生长,ACM A和ACM B对体内Li_(210)细胞周期作用相同.     

八肋游仆虫含绿色荧光蛋白基因的大核人工染色体的构建

为研究八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)相关基因的功能,构建了八肋游仆虫大核人工染色体(macronuclear artificial chromosome of E. octocarinatus,EoMAC-G),其两端为克隆自八肋游仆虫大核β2-微管蛋白基因的5′和3′非编码区和两侧的端粒序列,中间为多克隆位点和密码子优化后的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP-Eo) 报道基因. 用脂质体转染方法将携带有EoMAC－G的pBTub-Tel载体转入八肋游仆虫大核,分析EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达. 荧光显微镜观察发现,EGFP-Eo产生的荧光均匀分布于八肋游仆虫细胞质中. 在细胞进行有丝分裂的情况下,荧 光可持续20 d以上. 相比pEGFP-N1质粒转化的游仆虫,人工染色体中的EGFP-Eo基因表达的荧光亮度强、稳定且持续时间长. Western 杂交分析进一步证实,外源EGFP-Eo基因在细胞中过量表达. 通过细菌喂食法进行纤毛虫RNA干扰实验,抑制了外源EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达. 利用构建的人工染色体不仅可以在八肋游仆虫细胞内表达外源基因,对目的蛋白质进行活细胞实时动态的定位分析,还可通过RNA干扰的方法调控外源基因在纤毛虫细胞中的表达,便于进一步分析目的蛋白质的功能.     

值得注意的细胞周期调节蛋白

细胞周期调节蛋白在细胞周期的G_1期和S期交界处开始合成,S期结束后消失。细胞内定位在核内,又称分裂细胞核抗原。细胞周期调节蛋白含量与细胞分裂状况直接有关。细胞周期调节蛋白为细胞DNA复制所必须,是DNA聚合酶δ的活化蛋白。因此细胞周期调节蛋白对于真核生物DNA复制的调控及细胞分裂具有重要意义,值得重视。     

八肋游仆虫微管蛋白基因家族的鉴定及进化分析

为了系统分析八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)微管蛋白基因家族,从八肋游仆虫大核基因组中共鉴定得到20个微管蛋白基因,基于同源比对及系统进化分析,将其归入α、β、γ、δ、ε及η六个微管蛋白亚家族;多序列比对及Western blot结果显示八肋游仆虫η微管蛋白基因在翻译过程中需发生一次+1位编程性核糖体移码,其移码位点为AAA-TAA;所有自由生纤毛虫都含有多个α和β微管蛋白基因亚型,可能用于组成不同的微管结构。研究为后续深入探讨八肋游仆虫微管蛋白的生物学功能及微管多样性奠定了基础。     

人胃癌不同周期细胞膜表面ConA受体的分布与侧向运动

本文研究了人胃低分化粘液性腺癌细胞MGC 80-3不同周期时相中ConA受体的分布与侧向运动。MGc 80-3细胞经同步化培养,用F-ConA标记。被标记细胞中G_1、S和G_2期呈不连续的分布,但它们之间又存在显著的差异。M期呈较均匀的强荧光分布(与其它时相细胞比较)。荧光漂白恢复方法测定ConA受体复合物侧向运动表明:各个周期时相之间不仅运动方式不同,而且运动速率也有显著差异。M期与G_1期主要表现出扩散型运动;而S期与G_2期表现为流动型运动。G_1期的扩散系数大干M期的;S期的流动速率大于G_2期的。但可动分子百分比以G_2期最高。这些结果表明了ConA受体的动力学性质。它受到细胞周期的调节。     

青岛沿海七种腹毛类纤毛虫的形态学研究(原生动物,纤毛门)

借助活体观察及银染法等对采自青岛沿海的7种较罕见的腹毛类纤毛虫(拉氏游仆虫Euplotes raikovi,拟伍氏游仆虫Euplotes parawoodruffi,坚盾檐纤虫Aspidisca leptaspis,斯坦槽纤虫Aspidsca steird,收缩沙冠虫Psammnomitra retractilis,柔弱异列虫 Anteholosticha manca,条纹小双虫Amphisiella annulata)进行了形态学研究,包括两个国内新纪录:拉氏游仆虫,拟伍氏游仆虫,同时补充了各青岛种群的纤毛图式及银线系等资料.对迄今缺乏详细研究的拉氏游仆虫首次做了纤毛图式水平上的描述并在前人工作基础上给出了修订后的定义:活体约40～60 μn×25～40 μn,背部有明显的6列嵴突;口区延至虫体1/2后;口围带由23～35片小膜组成;额-腹棘毛包括7根典型棘毛以及位于额区中部的仅由1对毛基粒构成的退化结构;稳定的1根缘棘毛、2根尾棘毛;背触毛6～8列;银线系为double-patella型;海水种.     

大鼠肝癌细胞(CBRH-7919)的甲胎蛋白合成与细胞周期时相的关系

大鼠肝癌细胞(CBRH-7919)是一甲胎蛋白阳性的肝癌细胞系,适用为研究甲胎蛋白基因表达调控的体外模型。本文用免疫荧光法和免疫沉淀法在非同步的和同步的细胞样品中检测了甲胎蛋白在不同周期时相细胞内的合成情况。从免疫荧光反应结合~3H-TdR脉冲标记放射自显影和鉴别不同时相染色方法对比分析,说明该系肝癌细胞在晚G_1期荧光反应很弱,进入早S期胞质荧光明显增强,至晚S期胞质荧光又有减弱。免疫沉淀法检测同步的晚G_1、早S和晚S期细胞的结果,与细胞学所得结果一致。甲胎蛋白量是早S期高于晚S期,而S期又明显地高于晚G_1期。早S期是该系肝癌细胞合成甲胎蛋白的高峰时相。甲胎蛋白合成在不同时相细胞之间有明显差异,提示控制细胞周期进程有可能对甲胎蛋白基因的表达进行调控。     

感染环形泰勒焦虫(Theileria annulata)的牛外周血白细胞的形态观察

用光镜及扫描电镜观察了体外高代培养的含牛焦虫颗粒的牛外周血白细胞的形态及在细胞周期中细胞表面的特征性变化。这种经多年传代的含虫的牛外周血白细胞恢复了分裂和繁殖的能力,目前已成为较稳定的细胞系。细胞表面具多种伪足突起,如叶状、丝状及绒毛状。细胞周期中备期细胞表面的主要特征是:S期:细胞平扁,边缘具薄的时状伪足及丝状伪足;G_2期:细胞中部隆起,表面具少量绒毛状伪足;G_1期:绒毛状结构少或无,而出现丝状及小的叶状伪足,细胞仍保持球形;M期:细胞球形,表面密被以绒毛。作者根据扫描电镜的观察认为光镜下所观察的两类细胞,实际上是反映了一种细胞处于不同发育阶段时的特征。     

肝癌细胞与内皮细胞的粘附力学特性研究

采用细胞同步技术和微管吸吮技术,从细胞周期的角度研究不同细胞周期肝癌细胞(hepatocellularcarcinoma cells,HCC)与脐静脉内皮细胞(HUVEC)的粘附力学特性。结果表明,未同步化肝癌细胞各周期时相的细胞百分比为:G_0/G_1期,53.51％;G_2/M期,11.01％;S期,35.48％。采用胸腺嘧啶脱氧核苷、秋水仙碱顺序阻断和胸腺嘧啶脱氧核苷双阻断后释放培养的方法可分别获得G_1期和S期的肝癌细胞,其平均同步率分别为69.02％和96.50％。G_1期肝癌细胞与人脐静脉内皮细胞的粘附力比S期相应值明显降低(P<0.01),与未同步化肝癌细胞组比较也得到同样结果,而S期与未同步化肝癌细胞组的粘附力值无明显差别。肝癌细胞与脐静脉内皮细胞的粘附力随着粘附时间的变化而变化,在30～60min内迅速增长,60min之后维持在较稳定的水平,即300×10~(10)N左右。提示:在肝癌细胞与内皮细胞的粘附过程中,S期细胞可能起的作用更大;肝癌细胞和内皮细胞上粘附分子表达呈现时间效应,从而体现出粘附和去粘附的行为特征。     

人乳头瘤病毒E7蛋白对细胞周期G1/S检查点的影响

高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的发生关系已经明确,HPV编码的早期蛋白E7是HPV致宫颈癌的主要相关蛋白之一。G_1/S检查点是细胞周期中不可逆的关键点,决定了细胞进入细胞周期与否,与肿瘤的发生发展关系密切。pRb蛋白是调控细胞周期G_1/S检查点中的限速底物,是起调控作用的主要因子之一。E7通过影响pRb蛋白、E2F家族、Cyclin/CDK2复合物、p27蛋白、Dyrk1B等细胞周期相关蛋白来影响G_1/S检查点的正常工作,形成失控的细胞增殖。高危型HPV E7蛋白对细胞周期检查点的影响,既是HPV致癌机制的重要组成部分,也可能成为攻克此类癌症的突破口。本文综述了高危型HPV E7蛋白对细胞周期G_1/S检查点的影响。     

HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞周期相关基因表达的影响

本文研究HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞周期G_0/G_1期阻滞相关基因表达的影响。免疫细胞化学和核酸原位杂交检测结果显示,HMBA可明显上调p21~(WAFl/CIPl)、p16蛋白表达并增强p21~(WAFl/CIPl)基因转录,同时对CDK4、Cyclin D1蛋白表达以及c-myc基因转录均具有明显的下调作用。结果表明,HMBA可通过增强p21~(WAFl/CIPl)、p16基因表达而抑制Cyclin D1-CDK4活性,最终导致细胞进入S期所需的c-myc等基因转录活性下降,从而将细胞周期阻滞于G_0/G_1期,诱导人肝癌细胞分化。