抑制差减杂交法分离玉米幼苗淹水诱导表达基因

以淹水处理(submergence-treated, ST)的玉米(Zea mays L.)幼苗根部cDNA为目标群体,未处理(untreated, UT)的玉米幼苗根部cDNA为对照群体,进行抑制差减杂交.用经过UT差减的ST cDNA构建了一个含有大约2 000个独立克隆的差减文库.对随机挑取的408个克隆进行差异筛选,获得了184个在ST中特异表达或表达增强的候选克隆.对其中155个cDNA克隆测序并去除重复克隆后,共得到95个差异表达的cDNA片段.GenBank中BLAST查询结果表明:6个克隆为已知的玉米核苷酸序列;68个克隆与已知基因或EST序列部分区域的同源性为60%～90%;21个克隆在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因,或者由于序列位于变异丰富的3′端而无法查到与其他物种基因的同源性.     

抑制差减杂交法分离玉米幼苗淹水诱导表达基因

以淹水处理（submergence-treated,ST)的玉米（Zea maysL.)幼苗根部cDNA为目标群体,未处理（untreated,UT)的玉米幼苗cDNA为对照群体,进行抑制差减杂交。用经过UT差减的STcDNA构建了一个含有大约2000个独立克隆的差减文库。对随机挑取的408个克隆进行差异筛选。获得了184个在ST中特异表达或表达增强的候选克隆。对其中155个cDNA克隆测序并去除重复克隆后,共得到95个差异表达的cDNA片段。GenBank中BLAST查询结果表明;6个克隆为已知的玉米核苷酸序列;68个克隆与已知基因或EST序列部分区域的同源性为60%-90%;21个克隆在GenBank中无法查到对应的同源序列。可能代表了新基因。或者由于序列位于变异丰富的3′端而无法查到与其他物种基因的同源性。     

用RDA技术寻找肝再生相关基因的初步研究

利用表达性差异显示分析 (RDA)技术 ,研究大鼠 2 /3肝部分切除后 1h肝组织中基因的选择性表达 ,建立了大鼠 2 /3肝部分切除术后 1h再生肝组织选择性表达基因EST库。该库约含 3× 10 4 个独立克隆 ,其中 95 %以上的克隆含有插入片段 ,长度约 2 0 0～ 70 0bp不等 ,对随机挑出的 5 2个克隆的序列分析表明其中大多数基因与肝再生调控相关 (38/5 2 )。 10株未报道序列经RNA杂交证实 ,其中 6株与肝再生相关。     

大鼠再生肝中表达上调基因的筛选与鉴定

采用新发展的抑制差减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）在基因组水平筛选再生肝中高表达基因。大鼠肝部分切除后24h的再生杆组织来源的cDNA作为受检者（tester）,正常肝组织的cDNA作为驱动者（driver）,进行差减杂交,获得一900个克隆的差减杂交库,随后对差减克隆进行了差异筛选,得到50个在再生肝中高表达的强阳性克隆,序列测定和同源比较表明这些克隆代表了37个基因,其中13个与已报道的肝再生相关的基因同源,15个为忆知基因但首次发现与肝再生相关,9个为新的基因（EST）已被GenBank收录。制备了标准化RNA点杂交膜,通过对上述部分基因的RNA点杂交分析,不但确认了这些基因在再生肝中表达水平的升高,同时发现它们在肝再生过程中有不同的表达模式。实验结果提示这些基因在肝再生过程中具有重要功能。     

无核荔枝果实形成差异表达基因cDNA的克隆

采用抑制差减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)分离与海南无核荔枝果实形成相关的差异表达基因的cDNA片段,为克隆相关基因提供研究基础。分别以无核荔枝的有核幼果为driver;无核幼果为tester,建立差减cDNA文库。经Reverse Northern Dot-Blot筛选该文库,共获得61个阳性克隆,随机选取17个克隆进行测序,共获得10条非重复序列,对其中较长的7个序列进行同源分析,结果表明:有6个序列在荔枝中为首次报道。     

人参植物与皂苷生物合成相关的差减cDNA文库构建及基因差异表达分析

应用抑制差减杂交技术,分别以源于4年和1年生人参根组织cDNA群体作为检测子(tester)与驱赶子(driver),成功构建了与人参植物皂苷生物合成相关的差减cDNA文库,并时从中筛选的阳性cDNA克隆进行DNA测序及其序列分析、PCR及Northern印迹杂交鉴定．结果显示,获得的13个克隆为新基因序列．其中6个差减克隆系人参植物根生长发育阶段差异表达基因．目前,6个差异表达新基因的结构与功能仍在进一步研究中．     

文昌鱼性腺差减cDNA文库的构建

本研究以日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum)性腺cDNA为材料,应用抑制性差减杂交技术构建文昌鱼雌雄性腺的差减cDNA文库.正向差减杂交以卵巢为试验方、精巢为驱动方,反向差减杂交以精巢为试验方、卵巢为驱动方,将所获差减cDNA片段克隆插入质粒表达载体,转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含459、243个重组子.PCR 扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段,其中90%左右的克隆皆能扩增出有效产物,插入片段范围为200-600 bp,符合差减文库PCR产物片段的大小.随机选取30个阳性克隆测序分析,得到26有效基因片段,进一步从中选取16个序列,用实时定量PCR对文库质量进行验证,结果表明所建文库能够达到富集雌雄性腺差异表达基因的目的.文昌鱼性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定性腺分化和发育相关基因奠定了基础[动物学报 54(3):482-48 8,2008].     

用抑制差减杂交法分离和克隆梭梭幼苗受渗透胁迫诱导相关基因的cDNA片段

以Hoagland溶液培养的梭梭幼苗(H)为对照群体,甘露醇处理的梭梭幼苗(M)为目标群体,进行抑制差减杂交.用经过H cDNA差减的M cDNA构建了一个含有大约400个独立克隆的差减文库;采用差减前的H cDNA和M cDNA以及正向/反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针,对随机挑取的100个重组质粒进行差示筛选,获得了21个阳性候选克隆.从这些阳性候选克隆中随机挑取了8个进行Northern blot分析,证实其中3个候选克隆代表了在M中特异表达或表达增强的基因,序列分析和同源性比较表明它们与逆境胁迫有关;而另外5个候选克隆无Northem杂交信号,推测它们为低丰度转录本.     

用抑制差减杂交法分离和克隆梭梭幼苗受渗透胁迫诱导相关基因的cDNA片段

以Hoagland溶液培养的梭梭幼苗（H）为对照群体,甘露醇处理的梭梭幼苗（M）为目标群体,进行抑制差减杂交。用经过H cDNA差减的M cDNA构建了一个含有大约400个独立克隆的差减文库;采用差减前的H cDNA和M cDNA以及正向／反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针,对随机挑取的100个重组质粒进行差示筛选,获得了21个阳性侯克隆,从这些阳性候选克隆中随机挑取了8个进行Northern blot分析。证实其中3个候选克隆代表了在M中特异表达或表达增强的基因,序列分析和同源性比较表明它们与逆境胁迫有关;而另外5个候选克隆无Northern杂交信号,推测它们为低丰度转录本。     

柑橘钙结合蛋白基因的克隆及其在果皮褐变中的表达分析

从柑橘果皮褐变相关基因的差减cDNA文库中,筛选了一个与钙结合蛋白基因家族同源的EST片段,通过RACE技术克隆了其全长cDNA序列(CsCAB,GenBank登录号EF010854).CsCAB基因全长984 bp,含有一个621 bp的开放阅读框,编码207个氨基酸,预测蛋白质分子量为22.95 kD,理论等电点为4.5;序列分析结果显示CsCAB与钙结合蛋白具有很高的同源性,且具有钙结合蛋白的保守结构域EF-hand.Northern blot结果显示CsCAB在褐变果皮中上调表达,说明该基因与柑橘果实的果皮褐变有密切关系.     

The life and death of gene families

One of the unique insights provided by the growing number of fully sequenced genomes is the pervasiveness of gene duplication and gene loss. Indeed, several metrics now suggest that rates of gene birth and death per gene are only 10–40% lower than nucleotide substitutions per site, and that per nucleotide, the consequent lineage‐specific expansion and contraction of gene families may play at least as large a role in adaptation as changes in orthologous sequences. While gene family evolution is pervasive, it may be especially important in our own evolution since it appears that the “revolving door” of gene duplication and loss has undergone multiple accelerations in the lineage leading to humans. In this paper, we review current understanding of gene family evolution including: methods for inferring copy number change, evidence for adaptive expansion and adaptive contraction of gene families, the origins of new families and deaths of previously established ones, and finally we conclude with a perspective on challenges and promising directions for future research.     

利用套叠PCR技术进行基因突变和拼接

利用套叠PCR技术（又称重叠区扩增基因拼接法）对hGM-CSF基因内第28位氨基酸处的糖基化位点进行突变和进行人促性腺激素基因,腺苷酸激酶短肽与胰岛素样生长因子－基因三者之间的拼接,结果表明采用该技术能在体外实行有效的基因重组和定点突变,其成功率为100％,这一技术不需要内切酶消化和连接酶处理,技术操作员简单易行,在基因拼接,基因内部突变方面具有良好的应用价值。     

真核基因的快速克隆及表达

以细胞间隙连接蛋白基因Cx26作为目的基因,通过T-A载体介导,构建真核表达重组载体pcDNA3.1( ) /Cx26,重组表达载体转染人鼻咽癌细胞株HNE1,表达Cx26间隙连接蛋白。     

成簇基因的时空表达调控

成簇基因具有不同单个基因的特性,同一簇内基因大多有类似的结构,功能以及表达模式,基因之间时空表达模式及表达量高度协调,提示同一簇基因是作为统一整体进行调节的,具有共同的调节机制。基因成簇排列是实现基因时空协调表表达的基础,是遗传信息的一种高级组织形式,具有强大的进化优势,要揭示成簇基因表达调控的基本规律,应从顺式作用元件,反式作用因子,染色质等层次,进行整体的以及多基因相互作用的研究,这些机制的阐     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因,ｐｌ６基因为目的基因,将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游,构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６,并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

基因功能研究方法浅介

随着人类基因组计划的进展,数据库中积累了越来越多未知功能的基因序列,分析这些基因的功能将成为基因组计划的主要任务。本介绍了几种研究特定基因功能的方法及程序。     

运动能力相关基因的先天遗传与后天转移

对人体生理特性的研究结果显示,部分运动相关基因如α-肌动蛋白-3、血管紧张素I转换酶、Ⅱ型活化素受体B的基因多态性会明显影响运动员的运动天赋和体能。建立优秀运动员基因库,发现和鉴定可影响运动能力的基因变异体,使得在儿童中开展DNA测试,挑选适合某种特殊体育项目的运动天才和优化训练方法具有一定现实操作意义。另一方面,随着滥用基因技术以提高运动能力的可能性不断提高,部分基因有可能作为基因兴奋剂,通过基因转移的方法导入人体,其所涉及的伦理问题、对人类健康及社会的潜在危害等,已经引起了来自自然科学和社会科学不同领域的广泛关注。     

性别决定基因SRY的研究进展

SRY基因是哺乳动物性别决定过程中的主宰基因,其表达产物SRY蛋白是一种DNA结合蛋白,该蛋白含有一个HMG盒,能够以序列特异性结合到DNA双螺旋链的一侧,起到转录因子的作用。调节或协同下游基因如SOX9、AMH等基因的表达,使胚胎发育向雄性方向发展。     

硫霉素环化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达及基因定位

将含有硫霉素环化酶基因的重组质粒p6BCl2转化变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24,含有p6BCl2的转化子细胞抽提液分别与琉霉素生物合成阻断变株Y,发酵液以及纯化的Y。中间产物经过体外共培养可产生活性物质．化学分析表明与Y,发酵液混合后产生的是硫霉素,与纯化的Y。中间产物混合产生的是一种不稳定的活性物质。说明硫霉素环化酶基因在S.lividans TK24中得到了表达,其产物以Y。中间产物为底物并弥补了Y,中的缺陷。对p6Bcl2中4．5kb外源片段进行了限制酶酶切分析,建立了酶切图谱．利用含硫霉素环化酶基因的S．Lividans TK24转化子体外转化Y,的应用体系,将硫霉素环化酶基因定位在0．9kb Hinc I—Pst I片段上,并证明了硫霉紊环化酶的活性与IPNS同源片段无关。以上实验为进一步研究琉霉素环化酶基因的结构打下了基础。