对虾肠道中T-2毒素降解菌的分离纯化与鉴定

从新鲜健康的凡纳滨对虾肠道中分离筛选和鉴定降解T-2毒素微生物,为日后进一步研究T-2毒素(T-2)降解菌株的相关特性及其分布规律提供参考。取新鲜健康的凡纳滨对虾肠道,通过对该肠道菌群进行定性定量分析;从T-2与对虾肠道共培养液分离纯化得到6株优势菌株;将6株优势菌株分别和T-2在胰蛋白胨大豆(TSB)肉汤中进行共培养,采用LC-MS/MS法检测该培养液前后T-2含量,筛选得到T-2降解菌株,并用微生物鉴定仪VITEK2和16S rRNA鉴定目标菌株。TSB肉汤中检测T-2的标准曲线线性良好(R=0.999 5),T-2加标回收率为91.5%~108.4%,检测限为0.01 ng/m L,相对标准偏差为0.0%~8.4%和精密度为94.5%~107%。对虾肠道中的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)对T-2毒素降解率最高,分别达到91.8%和78.8%。     

自然环境中T-2毒素降解菌的筛选与鉴定

[目的]在自然环境中筛选和鉴定能够降解T-2毒素的菌株.[方法]取对虾养殖池水样、养殖池沉泥样品和对虾混合饲料中分离到的镰孢菌,于GYM产毒培养基中培养14 d后引入自然条件下气载细菌,继续培养至28 d,采用LC-MS/MS检测其中T-2毒素含量.然后结合稀释涂布、平板划线、革兰氏染色、镜检,从镰孢菌产毒培养液中毒素含量明显降低的菌悬液中筛选出T-2毒素降解菌,用16S rRNA分析方法对其进行系统发育分析及菌种鉴定,并验证两菌株的降毒能力与不同基质中二者的联合降毒能力.[结果]以从对虾养殖环境中分离到的5株镰孢菌作为试验菌种,在其产毒培养过程中分离到2株T-2毒素降解菌,16S rRNA鉴定结果分别为弯曲假单胞菌和尼泊尔葡萄球菌,对T-2毒素的降解率分别为90.9％和85.5％,但两者降毒能力并无显著差异(P＞0.05);其联合作用也有较好降毒效果,与两菌株单独作用无显著差异(P＞0.05),不同基质对其联合降毒作用影响不大(P＞0.05).[结论]新的T-2毒素降解菌的发现为进一步探明T-2毒素降解基因和开发T-2毒素生物降解酶提供了研究基础.     

T-2毒素对狂犬病病毒体外复制的抑制作用研究

探索T-2毒素对狂犬病病毒CVS-11的体外抑制作用。通过CCK-8法确定T-2毒素在BHK-21细胞中的工作浓度,根据T-2毒素、狂犬病病毒CVS-11与BHK-21细胞的相互作用方式建立T-2毒素体外抗狂犬病病毒的作用模型。采用直接免疫荧光、细胞荧光转化灶、实时荧光定量PCR等方法明确T-2毒素对狂犬病病毒CVS-11的体外抑制作用。CCK-8实验结果显示,T-2毒素与BHK-21细胞相互作用3h和24h的最大工作浓度分别为40ng/mL和10ng/mL。体外抗病毒实验的作用模型结果显示,增加T-2毒素浓度,狂犬病病毒CVS-11的病毒滴度和N基因mRNA的表达量逐渐下降,5ng/mL的T-2毒素对狂犬病病毒CVS-11抑制率可达90%以上,40ng/mL的T-2毒素对狂犬病病毒CVS-11具有灭活作用,灭活抑制率达80%以上。T-2毒素对狂犬病病毒具有体外抑制作用,且这种抑制作用具有剂量依赖性。     

N^＋注入诱变选育改善豆粕饲用品质的菌种研究

为了选育能够提高豆粕饲用品质的高效菌株,利用能降解胰蛋白酶抑制因子(trypsin inhibitors,TI)的枯草芽孢杆菌进行N+注入诱变,挑选碱性蛋白酶高产菌株,按出发菌的优化发酵条件与出发菌分别进行豆粕固态发酵,比较其TI兀降解效果,同时采用L16(45)正交设计对诱变菌株发酵豆粕的接种量、料水比、温度、发酵时间和通气量五个因素进行优化.在诱变能量为15 keY,剂量为1.5×1015ions/cm2时,筛到一株高产碱性蛋白酶的菌株KY-103,其酶活由诱变前21.39 U/mL提高到103.07 U/mL,胰蛋白酶抑制因子的降解率由19.58%提高到36.24%,小肽含量也由4.27%提高到7.89%.综合考虑的最佳发酵条件为15%的接种量,料水比1:1,通气量为60 g/500 mL,pH自然,在40℃下发酵96 h.此条件下胰蛋白酶抑制因子的降解率达43.92%,小肽含量达8.14%.结果提示,N+注入诱变可以获得改善豆粕饲用品质的高效枯草芽孢杆菌.     

鸡舍环境中tri5基因阳性镰孢菌的分离及其产毒特性

【目的】探讨利用tri5-PCR鉴定产毒镰孢菌的可行性以及tri5阳性菌株的产毒特性和产毒条件。评估鸡舍空气和固体基质中镰孢菌分离株中产单端孢霉烯族毒素潜力的发生率。【方法】利用编码单端孢霉烯族毒素合成酶的起始基因(tri5基因)对139株镰孢菌分离株进行PCR检测,并对tri5阳性菌株进行产毒培养,通过免疫亲和柱-高效液相色谱方法来检测培养产物中的T-2毒素和HT-2毒素含量。【结果】共筛选到42株tri5阳性菌株,其中分离自鸡舍空气中的10株tri5阳性菌株经产毒培养后7株菌株产生T-2毒素(1.36-5 ng/mL)或HT-2毒素(6.1-17.1 ng/mL)。在5℃-20℃间隔24 h变温、光照与黑暗间隔24 h交替、前期振荡后期静止的培养条件下培养9 d镰孢菌的产毒量最高;镰孢菌的产毒量与温度和时间显著相关,而与菌丝体干重无显著相关性。【结论】与传统鉴定产毒镰孢菌的方法比较,tri5-PCR更适用于快速、准确地检测大量鸡舍环境样本中的产毒镰孢菌。本研究为养殖环境的产毒镰孢菌的危害预警和控制提供技术支撑和理论依据。     

发酵甜高粱汁耐高浓度酒精酵母菌的选育

采用负染色计数法从非自然诱变菌株中成功地选育了一株以C4植物甜高粱汁做基质发酵生产液体生物燃料(酒精)的酵母菌株,产酒率最高达12.80%(V/V).     

产黄曲霉毒素B1降解酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化

以香豆素为唯一碳源筛选到27株能高效降解黄曲霉毒素B1(AFB1)的微生物菌株.用高效液相色谱检测AFB1含量的方法进行AFB1降解酶活力测定.以不同菌株发酵上清液中AFB1降解酶活力高低为复筛条件,筛选到AFB1降解酶活力最高的一株菌并命名为HSD8.该菌株经形态学、生理生化及系统发育学方法鉴定为Sinomonas sp..筛选所得最优菌株的发酵上清液中酶活达443 U/mL,通过单因素试验对其产酶发酵条件进行优化,以提高酶活.优化所得最佳发酵条件为:装液量50 mL/250 mL,发酵周期48 h,初始pH 5.0,接种量8％,发酵温度37℃,摇床转速160r/min.在最佳发酵条件下,该菌株发酵上清液中酶活可达548 U/mL,比优化前提高23.7％.优选菌株HSD8在生物降解黄曲霉毒素B1方面具有应用潜力,值得进一步研究开发.     

低温环境中T-2毒素降解菌的分离鉴定及特性研究

离筛选低温环境中T-2毒素的降解菌并探明其生化特性,探究T-2毒素降解微生物生化特性异同点,为T-2毒素降解微生物的检验提供生化判断参考。针对暴露于－20 ℃低温环境中的低浓度T-2毒素标准品,采用LC-MS/MS定量分析T-2毒素残留量,利用营养琼脂培养基（NA）和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）共分离出5株降解菌,16S rDNA结合生化鉴定结果为死谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis）、蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、弯曲假单胞菌（Pseudomonas geniculata）和尼泊尔葡萄球菌（Staphylococcus nepalensis）。这些分离株在－20 ℃条件下对低浓度T-2毒素均有不同程度的降解能力,其中蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）降解能力最强,降解率为91%。它们的理化特性具有很多相似性,主要表现在5株菌均不能利用D 塔格糖(dTAG）,对ELLMAN都表现出阴性;Bacillus vallismortis Bp1234-7、Pseudomonas geniculata Bp24-4、〖WTBX〗Staphylococcus nepalensis Bp124-5和Enterobacter cloacae Bp123-7都能分解D-葡萄糖,而Bacillus cereus Bp1234-8不能。     

一株PCBs降解菌的降解特性及发酵条件优化

【目的】针对一株多氯联苯的高效降解菌,考察其对多氯联苯(PCBs)的降解特性,并对降解条件进行优化。【方法】以不同浓度的2,4,4′-TCB与3,3′,4,4′-TCB为唯一碳源,研究苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium melilon)对不同多氯联苯的降解转化能力,并进行发酵条件优化以及共代谢试验。【结果】接入菌株转化7 d后,随着底物浓度的增加,该菌对2,4,4′-TCB的降解能力呈下降趋势。在最低浓度1.0 mg/L时降解率最高,为93.3%;而在最高浓度50.0 mg/L时为65.1%。对于较难降解的四氯联苯3,3′,4,4′-TCB,菌株在最低浓度1.0 mg/L时降解率为56.2%,最高浓度25.0 mg/L时为22.8%。在温度30°C、pH 7.0、接种量4.5 mL、装液量25 mL时,获得菌株转化10.0 mg/L 2,4,4′-TCB的最优发酵条件,7 d的降解率由原来的54.8%提高到83.6%。柠檬烯、香芹酮及甘露醇作为共代谢底物也可较好地提高菌株降解效果。【结论】苜蓿中华根瘤菌对PCBs有很好的降解效果,研究结果对PCBs的微生物降解及环境中PCBs的生物修复具有较好的意义和应用价值。     

微生物对烟叶蛋白质含量的影响

经菌株不同浓度、不同菌株、及同浓度不同菌株的等量组合处理过的烟叶放置一段时间未经发酵与发酵后对蛋白质检测,结果表明降解K326中部碎烟叶蛋白质的处理中Y菌株106浓度降解率最高,为18.81%;处理烟叶发酵后,降解率最高的处理是S5菌株107浓度,高达24.46%。K326上部碎烟叶处理后检测结果表明,对蛋白质降解率最高的处理是Y与S8混合,降解率为8.98%;K326上部碎烟叶处理发酵后检测结果表明,S8菌株108浓度处理降解率最高,达24.09%,其次为S5菌株108浓度处理降解率达23.48%。整叶处理结果表明S8降解蛋白质效果最好,降解率达5.17%;整叶处理烟叶发酵后检测S5对烟叶降解率最高,为5.17%。     

棉秸秆降解高温菌株的筛选及产酶分析

从新疆地区分离具有降解棉秸秆纤维素功能的菌株,得到4株耐高温真菌(50°C)。纤维素酶学性质分析表明,该4株菌的纤维素酶具有良好的耐酸性(最适pH为4.5)和耐高温性(最高达60°C)。以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、微结晶纤维素、棉花、滤纸、淀粉、果胶为底物测定酶活力,滤纸酶活力(FPA)最高达2.63 U/mL、淀粉酶活力最高达6.17 U/mL、果胶酶活力最高达5.86 U/mL。4株真菌酶学特性分析表明,该系列菌株在秸秆生物质利用方面有很大的应用潜力。     

木质素降解菌株的分离及其降解玉米秸秆过程中产酶特点

【目的】筛选高效降解木质素的菌株,并研究其以玉米秸秆为底物时木素降解酶活性。【方法】本研究以愈创木酚培养基和苯胺蓝培养基从吉林省不同经纬度的自然朽木及腐朽玉米秸秆土壤样品中分离、筛选得到高效降解木质素的菌株,并对其形态学鉴定,通过ITS序列分析构建系统发育树,分析菌株的分类地位。通过秸秆固体发酵过程产生的胞外木质素酶的活性分析,选出高效秸秆降解菌。【结果】筛选出1株高效降解秸秆的真菌,对其进行形态学特征和ITS序列分析,命名为白囊耙齿菌W2(Irpex lacteus W2)。该菌株在4–8 d内产生的锰过氧化物酶(Manganese peroxidase)呈上升趋势,并且在8 d达到峰值86.31 U/mL,与黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的最高酶活力45.86 U/mL相比,高出了88.20%(P0.01);该菌株的漆酶(Laccase)活力8 d时达到20.60 U/mL,比对照高40.76%(P0.05)。【结论】本研究分离到一株具有较强降解秸秆能力的真菌,初步鉴定为Irpex lacteus W2,具有较强的降解秸秆能力,其降解秸秆过程中产生较高的锰过氧化物酶与漆酶活力。     

木质纤维素酶高产菌株的筛选及其对玉米秸秆降解效果的影响

为了提高玉米秸秆中木质素的降解率,从腐烂的树枝和土壤中筛选木质纤维素酶高产菌株,以秸秆为唯一C源富集培养后,采用PDA-愈创木酚法进行初筛,筛选出产木质素酶真菌5株,然后以玉米秸秆为主要C源进行固态发酵和复筛。结果表明:第5号菌株在发酵玉米秸秆5 d后,使木质素的降解率达到最高(34.95%),粗纤维的降解率达到20.00%,显著高于其他4种菌株(P<0.05),其羧甲基纤维素酶比酶活达到116.35 U/g;10 d后,其木质素酶比酶活达到最高(45.64 U/g)。     

一株低温木质素降解菌的筛选、产酶优化及酶学性质

【背景】我国北方地区秋冬两季平均气温较低,低温环境使得秸秆更难自然降解。【目的】筛选高效低温木质素降解菌,探索其酶学特性并提高其产酶性能和秸秆降解效率。【方法】通过苯胺蓝法和酶活测定对菌株进行筛选,以Lip、Lac、Mnp酶活力为评价指标,采用单因素和响应面法进行产酶条件优化及酶学性质研究,通过固态发酵试验研究其对秸秆的降解效率。【结果】筛选到一株高效菌LS-1,经形态学和分子生物学鉴定其为嗜麦芽窄食单胞菌。菌株LS-1在木质素为碳源、蛋白胨为氮源、pH 8.0、培养温度15°C、培养时间3 d时产酶效果最佳,其中Lip酶活力为23.34 U/mL、Lac酶活力为9.37 U/mL、Mnp酶活力为50.89 U/mL。Lip和Lac最适作用温度为30°C且热稳定性良好,Mnp最适作用温度为50°C但热稳定性较差。Lac最适作用pH 4.0且耐酸性较好,Lip和Mnp最适作用pH 5.0;0.75 mmol/L Mg~(2+)和0.5%吐温-20对Lip有促进作用,1 mmol/L Cu~(2+)和丁香酸对Lac有促进作用,0.1%-0.5%吐温-20均对Mnp有促进作用。15°C固态发酵后,秸秆失重率达18.85%,木质素降解率达36.14%,比对照组提高约6倍以上。【结论】本研究为低温木质素高效降解提供了优质菌种资源,在秸秆降解方面具有良好的应用前景。     

内生Bacillus svelezensis HBB5菌株发酵盾叶薯蓣产薯蓣皂苷元的研究

目的探讨内生Bacillus svelezensis HBB5菌株发酵宿主植物盾叶薯蓣产薯蓣皂苷元的能力。方法接种内生B.svelezensis HBB5及B.subtilis ATCC 6633菌株(0.35×10~8 CFU/mL)至含盾叶薯蓣地下茎组织的液体培养基,32℃、165~185 r/min连续发酵108 h,检测发酵液细菌、pH、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、淀粉酶(α-amylase)及薯蓣皂苷元溶出率等指标。结果内生B.svelezensis HBB5菌株有较强的酸、碱耐受力[pH(4.8±0.2)~(8.4±0.2)],相比B.subtilis ATCC 6633[pH(5.2±0.2)~(8.7±0.2)]差异不明显;前者达峰值生长量(60×10~(8±2) CFU/mL)明显高于后者(32×10~(8±2) CFU/mL)。发酵36~60 h时,B.svelezensis HBB5、B.subtilis ATCC 6633菌株发酵液的淀粉、麦芽糖、葡萄糖浓度达峰值,分别为(37.41±3.12)、(27.83±2.14)ng/mL,(21.06±1.25)、(16.54±1.08)ng/mL,(54.33±3.12)、(36.65±2.10)ng/mL,前者均高于后者。同时,B.svelezensis HBB5菌株维持高的α-amylase酶活性及薯蓣皂苷元溶出率。结论内生B.svelezensis HBB5菌株拥有较强的耐酸碱、降解淀粉、提高薯蓣皂苷元溶出的能力,为工业生产薯蓣皂苷元提供了一个新的方法。     

L-乳酸发酵菌株的选育

以初筛得到的 1株干酪乳杆菌鼠李糖亚种突变株R2 (Lactobcilluscaseisubsp .rhamnosusR2 )为出发菌株 ,经紫外线、硫酸二乙酯、复合诱变处理 ,筛选出 1株产乳酸较高的突变株ZY ,L 乳酸含量达 93.9%。以正交试验为基础对发酵培养基进行优化 ,采用优化后的培养基发酵 4d ,残糖降至 0 .1 %以下 ,L 乳酸产量达9.5 7g/ 2 0 0mL ,对糖的转化率达 96 .3%。     

固定化硝化菌群联合芽孢杆菌处理对虾养殖废水

【背景】高度集约化的对虾养殖业面临着日益严重的水污染问题,同步高效降解养殖废水中的有机物、氨氮和亚硝酸盐是对虾养殖业健康可持续发展的重要保障之一。【目的】通过分别固定化硝化菌群(Nitrifyingbacterialconsortia,NBC)和芽孢杆菌,优化菌群空间结构,提高菌群功能,实现同步高效降解对虾养殖废水中的有机物、亚硝酸盐和氨氮,保障南美白对虾养殖的可持续发展。【方法】采集养殖虾塘底泥进行硝化细菌自养富集和连续培养,利用16S rRNA基因高通量测序技术分析硝化菌群组成。从5株芽孢杆菌中筛选化学需氧量(Chemical oxygen demand,COD)降解能力最强的菌株。选用吸附和成球效果好的无毒包埋材料,通过正交实验优化固定化配方提高机械强度。选择硝化菌群和芽孢杆菌最适使用浓度进行分别固定化并联合应用于对虾养殖废水的处理。【结果】高通量分析结果显示硝化菌群中变形菌门(Proteobacteria,61.10%)占绝对优势,具有自养硝化功能的类群丰度达12.69%并呈高多样性。还包含丰度达47.44%的具有反硝化功能或者潜在反硝化功能的优势菌群和丰度达12.85%的光合细菌,是高有机负荷下硝化作用的重要补充,并可通过反硝化作用实现真正脱氮。COD降解能力最强的是解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacien)YL-10,48h内COD降解率达100%。固定化最佳配方为贝壳粉5%、海藻酸钠3%、交联剂氯化钙为4%、优化后的固定化小球其机械强度可达129.68m N。固定化使硝化菌群的氨氮和亚硝酸盐降解率分别提高了128.13%和130.11%(P0.05),但对芽孢杆菌YL-10的COD降解率无明显提高。1×10~8 CFU/mL为硝化菌群和芽孢杆菌YL-10在养殖废水中最适使用浓度。在固定化硝化菌群和芽孢杆菌YL-10联合作用下,对虾养殖废水的氨氮、亚硝酸盐和COD浓度在48h内分别由初始的6.32±0.12、5.69±0.11和65.29±1.14 mg/L降至0.03±0.03、0.06±0.01和0 mg/L (P0.05),降解率分别为99.57%、99.03%和100%。【结论】通过优化固定化有效提高硝化菌群的硝化作用,联合COD降解能力强的芽孢杆菌,同步高效降解对虾养殖废水中的有机物、氨氮和亚硝酸盐,为规模化应用于南美白对虾高密度养殖提供科学依据。     

黑曲霉a-鼠李糖苷酶高产菌株的选育

本文首次报道利用Davis方法制备的透明圈法筛选α-鼠李糖苷酶高产菌株。用甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉孢子进行诱变处理, 用透明圈法初筛出的菌株中, 产量提高40%以上的突变菌株占11%; 用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛α-鼠李糖苷酶高产突变株T-226, 摇瓶培养α-鼠李糖苷酶活达373.4 U/mL, 比出发菌株提高了22.7%。对该高产突变株进行5 L罐发酵实验, 发酵84 h测得α-鼠李糖苷酶活为631.9 U/mL。用新建立的方法选育高产α-鼠李糖苷酶的高产菌株, 不仅具有较高的筛选效率, 还具有良好的准确性。     

玉米赤霉烯酮降解酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达

通过密码子优化、体外多拷贝构建实现玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)降解酶基因(zlhy-6)在毕赤酵母GS115菌株中的高效表达。按酵母密码子偏好性优化zlhy-6基因的密码子,与α因子信号肽编码序列一起合成,插入到pAO815质粒中,通过酶切酶连构建含1–6个表达盒的表达质粒,将其转入毕赤酵母GS115菌中,获得ZEN降解酶重组菌株。重组蛋白分子量为28.9 kDa,与预期一致。重组菌用甲醇诱导3 d,蛋白浓度达最高,之后下降;在pH 5.0、4.5条件下诱导培养,表达量最高;每天添加0.8%的甲醇、接种量10%表达水平最高;4拷贝的转化子表达水平最高,三角瓶发酵3 d,酶活性达到10 U/mL。在1 g玉米渣中添加0.1–0.5 mL发酵上清液,水解24 h,玉米渣中ZEN的降解率为44.08%–75.51%。研究结果为ZEN降解酶工业生产及在食品饲料中的应用奠定了基础。     

黑曲霉α-鼠李糖苷酶高产菌株的选育

本文首次报道利用Davis方法制备的透明圈法筛选α-鼠李糖苷酶高产菌株.用甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉孢子进行诱变处理,用透明圈法初筛出的菌株中,产量提高40%以上的突变菌株占11%;用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛α-鼠李糖苷酶高产突变株T-226,摇瓶培养α-鼠李糖苷酶活达373.4 U/mL,比出发菌株提高了22.7%.对该高产突变株进行5 L罐发酵实验,发酵84 h测得α-鼠李糖苷酶活为631.9 U/mL.用新建立的方法选育高产α-鼠李糖苷酶的高产菌株,不仅具有较高的筛选效率,还具有良好的准确性.