猪CFL2b基因部分序列的克隆及组织表达谱分析

在猪QTL定位基础上,利用比较基因组学原理,参照猪CFL2的cDNA序列,对猪CFL2基因的部分基因组DNA序列进行克隆、测序;利用RT-PCR半定量法检测CFL2基因在不同组织的表达情况.结果显示,所克隆的CFL2基因部分基因组DNA序列长度为2 377bp,包括4个外显子和4个内含子,该基因mRNA序列与已报道的人CFL2b基因序列相似性为89%;猪CFL2基因在多种组织中均有表达,但在骨骼肌和心肌中表达丰度较高.结果表明,本研究成功测序了猪CFL2b基因部分基因组DNA序列,为进一步研究该基因与肌肉发育及生理功能的关系奠定了基础.     

筛选转基因动物的新方法——PCR及其产物测序法

用特异性引物对肌球蛋白轻链2启动子(myosin light chain-2,MLC₂)-糜酶融合基因的转基因新生鼠鼠尾DNA进行PCR筛选, 低熔点琼脂糖凝胶电泳回收阳性样品PCR所扩出的DNA条带,纯化后用同一对引物中的一个进行单引物PCR测序,与所转外源基因序列比较,进一步确定整合有外源基因的阳性鼠.PCR及PCR 产物测序法检测转基因动物具有操作方便,灵敏度高及特异性强等优点.     

用基因组DNA剪接技术克隆SIgA相关基因

目的：克隆分泌型IgA（SIgA）相关基因--J链基因(IgJ)、多聚免疫球蛋白受体基因（pIgR）和IgA重链恒定区基因（IGHA）,为进一步构建SIgA真核表达质粒奠定基础。方法：采用本室建立的"基因组DNA剪接"技术,根据已发表的IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列,通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物,从人外周血基因组DNA中直接扩增各基因的外显子序列;然后人工设计融合相邻外显子的融合引物,采用重叠PCR技术,把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列,完成基因组DNA的体外剪接。扩增的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector中,通过DNA测序对阳性克隆进行分析鉴定。结果：PCR扩增的IgJ、pIgR和IGHA基因与预期大小一致;测序结果表明本实验获得的上述基因与GenBank中的目标基因序列完全一致。结论：本文通过基因组DNA剪接技术成功克隆人类SIgA三个相关基因,提示此技术是合成多外显子cDNA的有效手段。     

外来入侵杂草假苍耳的形态学及DNA分子鉴定

2019年在新疆塔城市进行入侵有害生物实地踏查中发现疑似假苍耳的植株,首先采用传统形态学鉴定方法,根据植物的根、茎、叶、花及果实等外部形态特征进行初步鉴定,再以植物的Rps16、psbA和matK基因序列为参考,设计特异性引物(分别为IXR、IXP及IXM)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和测序。通过形态学和DNA分子鉴定可知,采自塔城市的野生杂草为假苍耳,待检测植物基因测序片段与假苍耳psbA和matK基因序列的相似度高达98%,是我国入境植物检疫性有害生物之一。本研究建立了假苍耳的快速检测方法,可为新疆地区假苍耳的检验检疫及有效防控提供参考。     

耐苯唑西林乳酸杆菌mecA基因的分析

目的研究耐苯唑西林乳酸杆菌mecA基因的携带情况,分析其与耐药表型的关系,了解携带该基因质粒的可传递性。方法PCR检测mecA基因,双向测序得到基因序列,质粒电转化试验检测其传递性。结果耐受苯唑西林乳酸杆菌中81.6%的基因组总DNA、质粒DNA、质粒p5.8上均扩增出mecA基因序列保守区域,与GenBank中金黄色葡萄球菌的mecA基因、米酒乳杆菌的类mecA基因相似性分别为100%和59%。质粒p5.8成功电转化入乳酸乳球菌MG1363。结论乳酸杆菌苯唑西林的耐药表型与mecA基因的携带情况基本相符,携带耐药基因的质粒可通过人工转化,在部分细菌间水平传递,乳酸杆菌耐受苯唑西林的原因还需进一步探讨。     

亚硫酸氢钠测序法检测水稻FIE基因CpG岛甲基化状态

建立了适用于水稻基因组特定基因甲基化检测的亚硫酸氢钠测序法,并利用此方法对FIE2A基因CpG岛部分片段的甲基化差异进行了研究。采用CTAB法提取水稻叶片和胚乳细胞的基因组DNA,经亚硫酸氢钠化学修饰后,针对已修饰的FIE基因序列设计特异引物并结合巢式PCR扩增,TA载体克隆、测序,最后对测序结果进行分析。结果表明巢式PCR能够增加特异性产物的产生,FIE基因CpG岛在对称的CG和CNG位点甲基化水平较高,而在非对称CNN位点甲基化水平最低,此外在叶片中的平均甲基化水平较高。由此表明本研究建立的亚硫酸氢钠测序法适用于水稻基因组特定基因甲基化状态的检测。     

采用PCR-测序法对北京地区325例妇女宫颈脱落细胞样品中人乳头瘤病毒进行检测和基因分型

为了探讨PCR-测序法在宫颈脱落细胞样品中人乳头瘤病毒 (Human papillomavirus, HPV) 临床检测中的应用价值,采用HPV通用引物PGMY09/11针对HPV L1区基因序列进行PCR扩增,并通过DNA测序法对HPV进行基因分型。对于混合感染样品,利用HPV型别特异性引物PCR的方法进行基因分型。325例临床样品中,228例为HPV阳性,其中66例为混合感染。共发现27种不同的HPV型别,其中HPV 16比例最多,其次是HPV 58和52。高危型HPV检出率随病变程度加重显著性增加     

幽门螺旋杆菌单链抗体的筛选及鉴定

为了获得幽门螺旋杆菌特异性单链抗体scFv,通过噬菌体展示技术,首次直接用幽门螺旋杆菌细胞Hp对噬菌体单链抗体文库Tomlinson进行单链抗体的筛选,经5轮筛选后,通过ELISA方法检测,从随机挑选的96个克隆中获得了8株阳性克隆。再分别将阳性克隆与10种常见菌进行ELISA的交叉反应,最终得到1株特异性表达抗Hp的scFv的噬菌体JH1。随后又进一步对JH1所表达的scFv基因进行PCR扩增,分别得到scFv的VH片段、VL片段,全长基因分别为527bp、368bp和935bp,这些包含着部分载体序列的DNA片段与理论值相符。通过对scFv全长基因进行测序,在NCBI中进行基因序列比对,与已报道的一种植物RNA病毒的复制酶单链抗体基因序列有96％同源性。     

纳米孔基因测序技术在DNA甲基化修饰检测中的应用研究进展

DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰类型之一,其中哺乳动物基因组中最常见的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)甲基化修饰参与了许多重要的生命活动,其含量的异常与疾病,尤其是癌症的发生发展密切相关。当前检测5mC修饰最常用的方法是基于亚硫酸氢盐转化的第二代基因测序技术,该方法虽然转化效率高且测定准确,但仍然存在不足之处,包括DNA分子降解、处理过程繁杂、测序读长较短、检测特异性不高等。近些年发展起来的纳米孔基因测序技术凭借其能对DNA修饰直接进行检测,且具有读长长、通量高、速度快等特点,在DNA表观遗传修饰检测方面展现了良好优势。本文对DNA的5mC修饰的形成及其经典的检测方法进行了简要介绍,并重点介绍了纳米孔基因测序技术在DNA的5mC修饰检测中的应用研究进展。     

藏獒MC1R基因多态性与毛色表型的关联研究

目的:通过检测藏獒黑素皮质激素受体1(MC1R)基因的单链构象多态性(SSCP)在不同毛色群体中的分布,探讨MC1R基因多态性与毛色表型的相关性。方法:采用DNA测序技术,选择不同毛色藏獒的DNA为样本,根据GenBank发布的荷斯坦牛MC1R基因序列设计一对引物,采用PCR-SSCP技术分析MC1R基因在藏獒中的SSCP。结果:MC1R基因在藏獒中具有PCR-SSCP多态性,分别检测到3种基因型(AA、AB和BB);对MC1R基因多态性片段DNA克隆测序后发现,MC1R基因在编码区第313位存在单碱基突变(G→A),该突变导致第105位氨基酸发生由丙氨酸向苏氨酸的改变(T105A)。结论:MC1R基因的多态性与毛色性状不存在显著的相关性。     

利用末龄幼虫蜕和蛹壳对苹果蠹蛾基因的无创伤检测方法

苹果蠹蛾Cydia pomonella（L.）是我国重大农业入侵害虫,对我国果业健康发展造成严重威胁。在利用基因编辑等技术对相关基因进行功能研究时,通常采用单对交配策略对纯合突变体进行筛选。因此,在配对前明确个体基因型,避免对虫体造成损伤尤为重要。本研究分别收集末龄幼虫蜕（10个蜕）和蛹壳（1个、5个、10个、15个蛹壳）,通过基因组DNA提取、目的基因PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物测序,以评估该方法作为苹果蠹蛾基因检测的可行性。结果显示,以苹果蠹蛾末龄幼虫10个蜕及5个以上蛹壳提取的基因组DNA作为模板,扩增精巢特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Testis specific serine/threonine protein kinase,TSSK1）基因,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到单一、明亮的条带,经测序证实该产物是目的基因序列。基于高效及节约成本的原则,拟推荐利用10个末龄幼虫蜕或10个蛹壳提取基因组DNA、通过PCR扩增和测序进行苹果蠹蛾的无损伤基因型检测。本研究建立了一种利用幼虫蜕和蛹壳进行苹果蠹蛾无损伤、高效的基因检测方法,为提高苹果蠹蛾基因功能研究的效率奠定了基础。     

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达及鉴定

根据已知α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,ALDC)的基因序列,用PCR法从产气肠杆菌(Enterobacter oerogenes)中克隆到约0.8kb的DNA片段,经DNA测序证明是ALDC基因,将该基因重组到质粒pBV220中,转化大肠杆菌,实现了高表达,获得了目的蛋白表达量约50％的转化子;表达产物经鉴定具有ALDC酶活性,为可溶性表达．为下一步应用基因工程手段对其进行改造奠定了基础．     

最早传入北京地区的SARS冠状病毒S基因序列分析和克隆

SARS冠状病毒的spike(S)蛋白对病毒的致病力至关重要,也是机体特异性体液和细胞免疫主要针对的靶分子。从北京地区最早发现的SARS患者咽拭子细胞培养上清中提取病毒RNA,用反转录巢式聚合酶链式反应(RTPCR)分6个片段扩增出S基因全序列,用TA载体克隆后进行DNA序列分析,再通过重叠PCR将6个片段连接成一条完整的S基因并克隆测序。DNA测序结果表明病毒S基因序列与报告的BJ01株SARS冠状病毒S基因序列完全一致,用重叠PCR将6个S基因片段连接成了一条完整的S基因,插入到pGEMT载体后读序完全正确。上述结果表明最早传入北京地区的病毒与新近报告的BJ01株SARS冠状病毒在分子流行病学上具有同源特征,重叠PCR技术可以用于有效连接多个基因片段。S区全基因的克隆为进一步研究该基因的功能和DNA疫苗等研究提供了基础。     

药用昆虫神农洁蜣螂炮制品DNA条形码序列的测定与分析

当药用昆虫被加工炮制成碎块或粉末状态时,其昆虫类别和真伪的鉴别就显得十分困难。未经准确鉴定的药用昆虫会影响临床用药安全。为寻找准确、灵敏且快速的检测方法,采用DNA条形码技术,分别以药用神农洁蜣螂(Catharsius molossus)炮制品药材的完整和破碎个体为研究材料,对其mtCOI基因进行提取、扩增及测序分析,探讨DNA条形码技术对炮制后药用蜣螂鉴定的可行性。通过对不同DNA提取方法的比较,成功从炮制后干燥药材虫体内提取出总DNA并扩增出mtCOI基因片段。测序分析结果表明mtCOI基因序列能够区分神农洁蜣螂和其形态近似种。作为药用神农洁蜣螂DNA条形码标准片段的mtCOI基因序列已投递至GenBank。研究还表明,碎块状药用蜣螂药材中混杂有一定比例的其他昆虫。该结果有助于建立适合加工炮制后药用蜣螂的DNA条形码分子鉴定标准,并为保证临床用药安全提供支持。     

DNA微阵列技术及其在肿瘤生物学中的应用

人类基因组测序工作的完成使人们可以方便地调用任何基因序列,但仅有基因序列并不能解释众多的生物学问题,这要求发展一种高通量的技术用于研究基因的生物学功能以及基因的相互作用。DNA微阵列技术以其高通量的特点,已经在肿瘤生物学的研究中逐渐被采用。由于癌症是源于基因表达谱改变的基因疾病,通过DNA微阵列技术研究癌症细胞和对应的正常细胞的基因表达差异,将会使人们更好地了解肿瘤的形成和发展过程。     

伪品乌梢蛇PCR鉴别和蛇种溯源调查

目的利用基因序列同源性分析的方法对伪品乌梢蛇蛇种溯源调查。方法 (1)用PCR的方法对供试品进行鉴别;(2)利用通用引物扩增乌梢蛇对照药材和供试品COⅠ基因,将PCR产物进行测序,测序结果在NCBI进行BLAST序列同源性比对分析。结果 (1)在与对照药材凝胶电泳图谱300～400 bp处,无DNA条带,200～300 bp处有DNA条带;(2)基因序列同源性比对结果显示,对照药材为乌梢蛇,两个供试品均为灰鼠蛇。结论用PCR方法鉴别乌梢蛇是一种准确、客观的方法。利用COⅠ基因通用引物扩增的PCR产物进行测序和序列同源性比对,可以对蛇种进行溯源调查。     

高灵敏焦测序结合生物发光分析仪检测甲型H1N1流感病毒

目的:建立基于核酸序列分析的快速、准确、低成本的甲型H1N1流感病毒检测方法。方法:通过优化焦测序反应体系中ATP硫酸化酶和荧光素酶的浓度,建立高灵敏的焦测序反应体系;将该体系应用于低成本、小型化的便携式生物发光分析仪,焦测序分析流感病毒M、NP、HA基因片段的核酸序列。结果:优化后的焦测序反应体系可检测低至10 fmol的DNA样本,检测灵敏度较传统焦测序提高了10倍以上。对两例样本进行检测,根据所测得的M、NP、HA基因特异性片段序列,可以确认其均为甲型H1N1感染;另外,对M2蛋白阻断剂耐药性标志位点(S31N突变)的测定结果显示该病毒存在S31N突变,为M2蛋白阻断剂耐药型。结论:高灵敏焦测序体系结合便携式生物发光分析仪成功实现了对甲型H1N1流感病毒快速、准确的低成本检测。     

有效提取病毒诱导基因沉默植株中DNA的方法

根据PCR反应的要求,用改良的CTAB法,以番茄植株为材料,实现了微量番茄叶片基因组DNA的快速提取。提取基因组DNA所用的组织量少,所得的DNA经过电泳检测虽有降解,但足以用于PCR检测,以其作模板扩增中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶（Su）基因沉默植株中病毒组分中的DNAmβ和1.7 A,片段大小分别为1 300、500 bp。测序结果证明是相应基因的部分片段。该方法的材料不需要使用液氮,可以单人大批量提取,并在基因沉默的番茄植株中能稳定而准确的规模化PCR检测。     

人抗氧化基因GLRX2、TXN1的初步研究

对抗氧化酶系统和非酶系统同时进行研究是揭示细胞衰老和凋亡的新途径.GLRX2和TXN1是人体细胞内有关氧化还原反应的基因,分别编码抗氧化酶系统成员硫氧还蛋白和非酶系统成员谷氧还蛋白.根据GenBank已登录的GLRX2和TXN1基因序列设计适合转导的引物,以人类Hela细胞cDNA为模板进行目的基因的序列扩增,将目的基因转入大肠杆菌受体细胞,克隆出具有目的基因的重组质粒.提取带有目的基因的质粒DNA,通过测序对所克隆的目的基因进行了鉴定.本实验结果为GLRX2和TXN1基因在细胞内的表达和氧化还原反应机制的研究奠定了基础.     

含三倍体葡萄糖反应元件的质粒的构建及序列分析

用酚氯仿抽提法提取SD大鼠肝脏的基因组DNA,PCR扩增单倍体葡萄糖反应元件（glre）。分别用SacⅠ酶单酶切glre、pUC118载体后,连接、转化,PCR筛选出含三倍体glre的质粒并测序。结果PCR扩增出51bp的目的DNA片段,与文献报道的葡萄糖反应元件glre的大小一致;连接转化后,经PCR筛选出三倍体glre,序列分析显示其基因序列和Genbank数据库中的glre基因一致。以上结果表明构建成功含三倍体glre的质粒,为构建具双向调节的胰岛素分泌调控基因质粒奠定了基础。