白木香 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 合酶(AsHMGS)基因的克隆与表达分析简

以白木香（Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg）茎cDNA为模板,采用反转录PCR及RACE技术分离得到HMGS基因cDNA全长。序列分析表明该基因序列全长1 831 bp,共编码465个氨基酸,推导的蛋白质分子量为51.4 kD,理论等电点6.25,命名为AsHMGS。推导的AsHMGS蛋白质序列具有植物HMGS酶的典型结构,并预测出HMGS酶的活性中心。系统进化树分析表明,AsHMGS蛋白与拟南芥、琴叶拟南芥、芥菜的相应蛋白相似度最高,其次为人参、喜树和野茶树。荧光定量PCR结果显示,茉莉酸甲酯能诱导白木香AsHMGS的表达。     

茶树脂氢过氧化物裂解酶基因CsiHPL1的克隆及表达

根据茶树基因CsiHPL1的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法从茶树品种龙井43′中克隆了CsiHPL1序列,并分析了CsiHPL1在生物和非生物胁迫下的诱导表达情况及亚细胞定位。结果表明,CsiHPL1包含一个1 476 bp的最大开放阅读框,编码491个氨基酸,预测为13-HPL基因。Real-Time PCR分析结果表明,CsiHPL1的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤和茉莉酸的诱导;构建了CsiHPL1与绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组表达载体,经农杆菌瞬时转化烟草叶片,利用激光共聚焦显微镜在叶绿体中观察到GFP荧光,表明CsiHPL1编码的蛋白质为叶绿体蛋白质。     

番茄 DEAD-box RNA 解旋酶基因 SlDEAH1 的克隆及表达分析简

DEAD-box RNA解旋酶是一种特殊的RNA分子伴侣,参与了RNA代谢,包括前体RNA剪接、核糖体合成、RNA降解以及基因表达,并对植物的发育和抗性等也具有重要作用。根据已报道的拟南芥DEAD-box蛋白,通过同源比对,在NCBI据库中筛选得到一个DEAD-box RNA解旋酶同源蛋白,命名为SlDEAH1,并根据其基因序列设计特异引物,应用RT-PCR方法从野生型番茄（Solanum lycopersicum）AC⁺⁺中克隆得到了该基因的全长编码区序列。利用生物学网站、软件及实时荧光定量PCR方法,对其进行生物信息学、表达模式、胁迫及激素处理分析。结果表明：SlDEAH1包括2 073 bp的开放阅读框,编码690个氨基酸残基,其编码蛋白有9个保守结构基序,其所涉及到的ATP结合、ATP水解及RNA结合等功能对于解旋酶活性是至关重要的;表达模式分析表明SlDEAH1基因可能在野生型番茄萼片、叶片发育及果实成熟方面起到重要作用;高温、低温、脱水、伤害、盐胁迫不同程度的诱导了SlDEAH1的表达,但在根中该基因的表达受盐胁迫抑制;ABA、ACC、IAA、GA₃、MeJA和ZT均不同程度诱导了SlDEAH1的表达,其中ABA诱导效应最为明显。这些结果为进一步研究SlDEAH1在番茄发育和胁迫响应中的功能奠定了基础。     

重组蛋白GST-OsCATB的表达特性研究

为了阐明水稻Catalase（CAT）的酶学功能,首先需要获得出足量的、活性的该酶蛋白。本研究克隆了水稻OsCAT_B基因(GenBank accession No.D26484),构建到原核表达载体pGEX-6p-3中形成重组蛋白,继而转入E.coli菌株BL21中进行表达特性研究。结果表明,GST-OsCAT_B融合蛋白在E.coli中进行了过量表达,表达受到诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度和诱导体系等多因素影响;通过谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析,纯化出足量、活性的融合蛋白GST-OsCAT_B,每克表达细胞（干重）中得率为51 mg GST-OsCAT_B。     

丹参ACC氧化酶基因(SmACO1)的克隆与序列分析

依据丹参转录组数据库序列信息,采用RT-PCR和染色体步移技术从丹参中首次克隆得到ACC氧化酶基因,命名为SmACO1(GenBank注册号为JQ026111)。该基因gDNA序列长1 347 bp,由3个外显子和2个内含子组成;cDNA全长1 117 bp,包含945 bp的开放阅读框,编码314个氨基酸残基。生物信息学分析显示SmACO1为无信号肽与跨膜结构域,且定位于细胞质的稳定亲水蛋白,含有Fe²⁺依赖的加氧酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,SmACO1基因在丹参不同组织器官中差异表达,花中表达量最高;其表达受到病原菌和茉莉酸甲酯的诱导,表明SmACO1基因可能在植物防御反应中发挥作用。     

油菜BnMKK2基因的克隆及表达分析

通过实验从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAPK激酶基因BnMKK2基因的cDNA,全长1 344 bp,其中包括5′非翻译区（5′UTR）111 bp,3′非翻译区（3′UTR）165 bp,开放阅读框（ORF）长1 068 bp,编码355个氨基酸,该基因编码的蛋白质分子量为39.3 kDa,理论等电点为6.8。与拟南芥AtMKK2有很高的同源性,因此命名为BnMKK2(GenBank登录号:HQ848661)。该基因实时荧光定量PCR分析表明,BnMKK2基因的表达受低温胁迫诱导。     

丹参咖啡酸-O-甲基转移酶基因(SmCOMT1)的克隆及其分析

依据丹参转录组数据库得到的咖啡酸-O-甲基转移酶基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法从丹参分离得到一个新的COMT基因,命名为SmCOMT1(GenBank注册号为JF693491）。该基因cDNA全长1 158 bp,包含一个长为1 095 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。SmCOMT1 gDNA序列长2 275 bp,包含4个外显子和3个内含子。序列分析结果表明,SmCOMT1编码的多肽具有COMT的序列保守元件,与同科植物罗勒COMT编码的多肽高度同源,同源性达到89%。系统进化树分析表明,SmCOMT1与双子叶植物的COMT亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,SmCOMT1基因在丹参不同组织器官中差异表达,其中茎中的表达量最高,并且其表达受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导,显示SmCOMT1基因可能在植物防御反应中发挥作用。     

朵丽蝶兰 MADS-box 基因 DtpsMADS1 的克隆与表达特性简

植物MADS-box基因家族编码高度保守的转录因子,参与了包括花器官发育和开花在内的多种发育进程。为阐释兰科植物成花的分子调控机制,根据MADS-box基因保守序列设计简并引物,用RACE方法从朵丽蝶兰花葶中克隆到1个MADS-box家族基因,该基因cDNA全长960 bp,包含37 bp 5′UTR,一个738 bp的开放阅读框(ORF)和185 bp 3′UTR,共编码245个氨基酸。序列和系统进化树分析表明,该基因与其他植物的MADS-box基因具有很高的同源性,属于AP1/FUL-like亚家族,命名为DtpsMADS1,GeneBank登录号为JQ065097。实时荧光定量PCR检测结果显示：DtpsMADS1具有明显的组织表达特异性;在根和叶中,DtpsMADS1在花前期和花后期表达量较高;苗期和盛花期表达量较低;DtpsMADS1在花葶中的表达趋势与根和叶相似;而在花器官中,DtpsMADS1只有痕量表达。由此推断,DtpsMADS1可能参与开花进程调控,而不参与花器官的形态建成。     

天山雪莲SikGLP基因的克隆及表达分析

从天山雪莲cDNA文库中分析得到一个类萌发素蛋白基因序列,命名为SikGLP。生物信息学分析表明,该基因包含1个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸。SikGLP分子量为21.6 kDa,理论等电点是6.81,并且是具有信号肽的疏水性蛋白。氨基酸多序列比对发现GLP序列保守性较高,具有的GLP的典型特征。17个物种间的系统发育树可以看出与葡萄GLP进化关系最近。Real time-PCR检测表明,SikGLP基因受低温、甲基紫精和PEG诱导表达,可能在胁迫初期对提高植物防御起作用。     

番茄泛素蛋白基因LeEBF1和LeEBF2的克隆表达分析

通过RACE和RT-PCR方法从番茄中克隆了LeEBF1（EIN3 binding F-box protein 1）和LeEBF2（EIN3 binding F-box protein 2）的全长cDNA序列,两个基因LeEBF1、LeEBF2全长分别是2 866和2 891 bp,对序列的分析表明,它们的开放阅读框分别是1 911和1 995 bp,编码区编码637和665个氨基酸残基,在氨基端含保守的F-box区域和在羧基端有14个亮氨酸重复单位,通过BLAST软件和DNAMAN分析表明这两个基因的氨基酸序列与拟南芥EBF1和EBF2有58.6％相似,同时又与其他物种的EBF蛋白的F-box区域比较有24.4％到73.2％的相近。Northern杂交指出：LeEBF1与LeEBF2在野生型和Nr的幼叶中的表达量高于成熟叶;当在果实发育期,LeEBF1与LeEBF2在青果期的表达量相比其他时期要弱。初步结果表明,LeEBF1与LeEBF2可能在番茄的生长发育中起着重要的作用。     

AtsHsp17.6-CⅠ和AtsHsp17.6-CⅡ基因对非生物胁迫的应答研究

小分子热激蛋白是植物受到热胁迫后的主要表达产物之一,与植物细胞耐热有密切关系。该研究发现,拟南芥小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6-CⅠ和AtsHsp17.6-CⅡ 除热激之外,重金属离子Ni⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Al³⁺均能诱导这2个热激蛋白基因的表达;氧化胁迫和渗透胁迫同样也能诱导它们表达。该研究将由CaMV35S启动子驱动的这2个小分子热激蛋白基因导入拟南芥,RT-PCR分析表明,2个小分子热激蛋白基因在转基因植物中呈现组成型表达。实验结果表明,组成型表达小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6-CⅠ的转基因植物表现出对6 μmol·L^-1 Cd²⁺胁迫、0.4% NaCl胁迫的耐受性。研究表明,这2个小分子热激蛋白基因可能参与着多种抗逆途径,推测其能够减轻或抵抗逆境胁迫引起的伤害并对其进行修复。     

番茄 SlDP1 基因的克隆、生物信息学及表达特性分析简

DP基因属于DP/E2F转录因子家族,其编码的蛋白是E2F蛋白的二聚化分子伴侣,可能参与调控细胞周期、DNA复制、生长、分化、凋亡等多种细胞进程。根据SGN数据库登录的番茄序列,通过RT-PCR方法从野生型番茄中克隆了一个DP基因,命名为SlDP1。生物信息学预测,SlDP1蛋白定位于细胞核,具有保守的DNA结合域、二聚化区域和C-末端及多个磷酸化位点。蛋白质二级结构预测SlDP1蛋白含51.50%的环状结构,34.55%的α螺旋和2.66%的β折叠。荧光定量PCR分析外源激素对野生型番茄SlDP1基因表达量的影响,发现该基因受外源性乙烯前体ACC的诱导。对环境因子应答的RT-PCR结果表明,在伤害和盐处理的叶中该基因表达不受诱导,而盐处理的根中该基因表达量提高。SlDP1基因表达模式分析表明,该基因在根、花、萼片及成熟时期果实中表达量较高。这些结果为进一步研究SlDP1基因在番茄生长发育过程的功能奠定了基础。     

A New Allergen from Ragweed (Ambrosia artemisiifolia) with Homology to Art v 1 from Mugwort

Art v 1, the major pollen allergen of the composite plant mugwort (Artemisia vulgaris) has been identified recently as a thionin-like protein with a bulky arabinogalactan-protein moiety. A close relative of mugwort, ragweed (Ambrosia artemisiifolia) is an important allergen source in North America, and, since 1990, ragweed has become a growing health concern in Europe as well. Weed pollen-sensitized patients demonstrated IgE reactivity to a ragweed pollen protein of apparently 29–31 kDa. This reaction could be inhibited by the mugwort allergen Art v 1. The purified ragweed pollen protein consisted of a 57-amino acid-long defensin-like domain with high homology to Art v 1 and a C-terminal proline-rich domain. This part contained hydroxyproline-linked arabinogalactan chains with one galactose and 5 to 20 and more α-arabinofuranosyl residues with some β-arabinoses in terminal positions as revealed by high field NMR. The ragweed protein contained only small amounts of the single hydroxyproline-linked β-arabinosyl residues, which form an important IgE binding determinant in Art v 1. cDNA clones for this protein were obtained from ragweed flowers. Immunological characterization revealed that the recombinant ragweed protein reacted with >30% of the weed pollen allergic patients. Therefore, this protein from ragweed pollen constitutes a novel important ragweed allergen and has been designated Amb a 4.     

薇甘菊乙醇酸氧化酶基因的克隆、序列分析和原核表达

利用SSH和RACE相结合的方法获得了薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长,并对该序列进行了生物信息学分析。随后将该基因的cDNA编码区克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒,转化到大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行表达。序列分析表明,薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长1 363 bp,编码369个氨基酸,命名为MmGO（GenBank登录号EU716626）,推测的MmGO分子量为40.32 kDa,等电点为8.99。系统进化分析表明,MmGO与芸苔的GO序列亲缘关系比较近。将该基因重组到pET-32a(+)中进行原核表达,经0.1 mmol·L^-1 IPTG,25℃诱导4 h,获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His MmGO,Western-blot证实表达的6×His-MmGO能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为60 kDa,与预测的融合蛋白6×His-MmGO分子量相符。为进一步研究融合蛋白6×His-MmGO的活性和功能奠定了基础。     

小苍兰ACC合成酶FhACS1基因的克隆与序列分析

以小苍兰品种“上农金皇后”为研究对象,利用PCR技术和染色体步移技术首次克隆到了ACC合成酶FhACS1基因的全长序列和编码序列。结果表明：FhACS1基因全长为2 576 bp,包含长为433 bp的5′端非编码区序列（5′-UTR）以及长为373 bp的3′端非编码区序列（3′-UTR）;开放读码框（ORF）长度为1 371 bp,推定编码457个氨基酸。分析表明,该基因包含3个内含子和4个外显子。序列分析结果显示,FhACS1推导蛋白具备ACS蛋白的7个保守结构域;在氨基酸水平上,FhACS1与小果芭蕉的同源性最高（85%）;系统进化分析表明,FhACS1与孟宗竹BaACS（BAC56949.1）、水稻OsACS1（AAA33888.1）、小果芭蕉MaACS1（AAQ13435）的亲缘关系最近。在其已知启动子区域,发现有多个对脱落酸、赤霉素、细胞分裂素等激素响应的顺式元件,以及对干旱和低温等逆境胁迫响应的顺式元件。     

Sequential gel mobility shift scanning of 5′ upstream sequences of the Neurospora crassa am (GDH) gene

We have used gel mobility shift assays to scan 1.7 kb of 5′ non-coding sequence of the am (glutamate dehydrogenase) gene of Neurospora crassa for binding by partially fractionated Neurospora proteins. Using genetic analysis this region had been shown to play an important role in the control of glutamate dehydrogenase (GDH) expression. Gel mobility shift analysis identified three regions to which Neurospora proteins bind specifically. Two of these corresponded to the two elements previously defined by genetic analysis (URSamα and URSamβ). The third protein binding site appears to be unrelated to am gene expression. Competition experiments showed that the proteins that bind to the URSamα and URSamβ elements are different. The URSamα element was shown to contain two independent binding sites for the URSamα binding protein(s). Both fragments contain a CCAAT motif, suggesting that URSamα binding protein(s) may be members of one of the CCAAT-binding protein families. The effect of deletion of either the URSamα or URSamβ elements on catabolite induction of am expression was also determined. Both elements appear to act as constitutive enhancers of gene expression.     

NaCl处理下两种补血草种子萌发和幼苗抗性的比较

用不同浓度的NaCl处理盐生植物黄花补血草和大叶补血草,研究其种子萌发和幼苗叶片中叶绿素和可溶性蛋白等各项生理指标的变化,分析比较这两种植物的耐盐性。结果表明,NaCl处理抑制两种补血草种子的萌发,此效应具有浓度依赖性,低浓度的NaCl促进黄花补血草根和大叶补血草茎叶的生长,高浓度的NaCl抑制两种补血草幼苗的生长;与对照比,50、150和300 mmol·L^-1 NaCl处理后,两种补血草幼苗叶片的叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和叶绿素总量均减少,而H₂O₂和MDA含量却增加;低浓度的NaCl处理使两种补血草幼苗叶片可溶性蛋白含量增加,而高浓度的NaCl处理使其可溶性蛋白的含量降低。此外,相同浓度的NaCl处理对大叶补血草种子萌发、叶绿素含量等指标的抑制作用明显强于黄花补血草,且其MDA产生明显强于黄花补血草,这些表明黄花补血草可能比大叶补血草具有较强的耐盐性。     

白桦开花位点Flowering Locus T（FT）基因的分离及其表达

FT及其同源基因在促进植物成花和发育阶段转变过程中起重要作用。应用RT-PCR和RACE技术分离了白桦FT基因的cDNA,全长为928 bp,其开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸。预测的蛋白质分子量为19.6 kDa,理论等电点为7.73。该预测蛋白序列含有保守的PEBP蛋白结构域,命名为BplFT,并在GenBank注册,登录号为JQ409561。该基因序列同其它16种植物的相似性为74%～93%,其中与无花果（Ficus carica）的相似度最高为93%,与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的相似度最低为74%,并构建了该基因序列的进化树。通过qRT-PCR的方法检测BplFT基因在白桦不同时期不同组织中的转录表达,在营养器官的表达高于花器官,成熟组织要高于幼嫩的组织,在成熟茎中的表达量最高,推测BplFT基因在成熟的营养器官发育中起重要作用,并可能参与调控次生细胞壁的形成。另外,选择了白桦雄花序突变体进行该基因的转录表达分析,该基因在突变体雌花序、雄花序、幼叶及幼茎中均为上调表达,预示着BplFT基因不仅仅参与营养组织发育,在花器官发育中也具有一定的作用。     

SLPI prevents cytokine release in mite protease-exposed conjunctival epithelial cells

House dust mites are a major source of allergens associated with allergic diseases including allergic conjunctivitis. Here, we demonstrate that mite-derived serine protease activity induces the release of cytokines from human ocular conjunctival epithelial cells in vitro and innate antiproteases, secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) and α1-antitrypsin, can inhibit the response. An extract prepared from a whole-mite culture induced the release of IL-6 and IL-8 and upregulated their gene expression in the human conjunctival epithelial cell line Chang, responses which were inhibited not only by a synthetic serine protease-specific inhibitor, AEBSF, but also by SLPI and α1-antitrypsin at a physiologically relevant concentration. The findings suggest a homeostatic role for SLPI and α1-antitrypsin against the proteases contained in allergen sources in the ocular conjunctiva and that exposure to house dust particles containing mite-derived serine protease activity could be involved in the initiation of sensitization through the ocular conjunctival epithelium and/or exacerbation of allergic conjunctivitis.