丙型肝炎病毒靶向药物及抗病毒药物筛选

丙型肝炎由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染所致,约80%感染者可发展成慢性肝炎,甚至肝硬化和肝癌。目前,临床主要应用干扰素结合利巴韦林联合疗法治疗丙型肝炎,但治疗后病毒有效应答率不高,并伴有明显的副作用产生,迫切需要研发靶向药物。随着HCV体外细胞培养技术获得的突破性进展以及在此基础上各种药物筛选方法的建立,利用现有的筛选模型筛选靶向药物成为抗病毒药物研发的重要途径。近年来,将GFP、hRLuc等报告基因插入HCV基因组中改造成具有明显标记的高通量药物筛选体系,已初步筛选出一些有效的HCV靶向药物,就现有抗丙型肝炎病毒靶向药物及抗病毒药物筛选方法进行综述。     

丙肝病毒全基因组克隆转染细胞体系的初步研究

采用一种含有HCV全基因组和噬菌体T7启动子和终止子序列的载体(pHCV)转染Vero-E6细胞,随后感染高效表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒(vTF7-3),通过vTF7-3的辅助作用,使Vero-E6细胞高效增殖HCV病毒体,建立了一种新的HCV体外细胞培养体系.RT-PCR、荧光定量PCR检测转染细胞裂解液中HCV滴度的结果显示pHCV转染细胞内HCV基因拷贝达107-108/mL,同时有HCV正链RNA合成;免疫印迹显示该培养体系中有HCV结构蛋白、非结构蛋白的表达;pHCV转染细胞经透射电镜观察,可见清晰的HCV病毒体,直径在40-50nm.这一新体系的初步建立,为研究HCV的复制机制、制备HCV疫苗和研发抗病毒药物奠定了基础.     

三种丙型肝炎包膜感染性假病毒颗粒的制备及初步应用研究

本研究构建携带HCV代表株H77(1a)、中国HeBei株(1b)以及JFH-1株(2a)丙型肝炎病毒完整的E1-E2包膜糖蛋白基因的表达质粒,间接免疫荧光法及Western blot验证了其在细胞膜(293细胞)上的正确表达.三种包膜质粒分别与慢病毒包装质粒pHR'CMV△8.2及携带EGFP报告基因的自灭活(Self-Inactivating,SIN)转移质粒pCS-CG共转染293FT细胞,产生三种不同基因型的丙型肝炎包膜感染性假型(pseudotyped)病毒颗粒,免疫荧光与Western blot分析验证了E1/E2包膜糖蛋白在假病毒颗粒上的表达与掺人,利用p24 ELISA法及感染性实验对HCV假病毒进行滴定.从上清中获得的HCV假病毒可以在体外感染肝癌细胞系Huh7及Huh7-CD81(且后者上的感染效率约为前者上的2～3倍);利用针对HCV E2蛋白的具有广谱交叉中和活性的单克隆抗体AP33建立了基于上述假病毒颗粒的丙肝病毒体外中和抗体滴定方法,并应用于丙型肝炎患者体内的中和抗体水平的研究.本研究成功包装了包括中国流行株在内的3种不同基因型的HCV包膜感染性假病毒颗粒并建立了基于假病毒颗粒的HCV体外中和抗体检测方法,为研究HCV感染早期特性及特异抗病毒药物的体外筛选提供了有效模型,并可用于HCV感染者体内及HCV基因工程疫苗免疫后中和抗体水平的分析.     

整合缺陷型重组慢病毒载体构建及HCV重组假型慢病毒颗粒的制备与性状分析

为提高慢病毒载体应用的安全性及改进HCV新型颗粒疫苗的制备,首先对传统的慢病毒三质粒系统进行改造:将包装质粒pHR' CMV△R8.2改造成整合缺陷型的包装质粒pHR'CMV△R8.2D64E,并在体外感染实验验证其整合缺陷性;将转移质粒中的报告基因GFP替换成HCV的NS3基因,选用表达3种亚型(1a、1b、2a) HCV包膜E1E2的包膜质粒,用改造后的三质粒系统制备了3种亚型(1a,1b,2a)的假型丙型肝炎病毒(HCV)整合缺陷型慢病毒颗粒,并用Western blot方法确定了颗粒上包膜蛋白的表达,通过电镜可观察到浓缩后的HCV慢病毒颗粒结构,HCV慢病毒颗粒感染Huh7细胞后可观察到转基因NS3的表达.为安全高效的慢病毒载体的应用及HCV假型颗粒疫苗研发提供了新的技术路线.     

丙型肝炎病毒感染实验动物模型的研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）感染是导致人类慢性病毒性肝炎、肝硬化和肝癌的最主要病因之一。由于缺乏合适的HCV感染实验动物模型,使得针对HCV感染更为有效的疗法及疫苗的研发滞后。黑猩猩是HCV感染研究的最佳实验动物,但由于其来源有限、价格昂贵及临床症状等诸多问题,其应用受限,因此发展新的实验动物模型用于HCV感染相关的基础和应用研究迫在眉睫。近年来,以啮齿类等动物为替代模型取得了不少进展,应用转基因等实验技术使替代动物感染了HCV,并成功应用于多个学科领域的研究。本文分析了HCV自然感染的实验动物、自然感染和非自然感染的替代实验动物在致病机制研究、药物评价和疫苗研发应用中的优缺点及未来研究趋势。     

HIV-1广谱中和抗体筛选技术的研究进展

HIV-1广谱中和抗体(HIV-1 bNAbs)是一类可以中和大多数流行株的抗体。HIV-1 bNAbs的研究可以为抗艾滋病药物提供候选分子和为艾滋病疫苗设计提供指导,是评估艾滋病疫苗效果的重要指标之一。HIV-1 bNAbs可通过传统筛选技术获得,如杂交瘤技术、EBV转化和展示库技术等。近年来,随着单细胞克隆和分选技术的发展,HIV-1 bNAbs的筛选效率和抗体特异性显著提高。多项技术结合的筛选手段和新型筛选技术LIBRA-seq,以及生物信息学辅助的筛选技术将抗体序列和功能信息统一起来,为HIV-1 bNAbs筛选和疫苗设计提供技术支持。除了HIV-1,这些筛选技术和方法也可用于其他病毒bNAbs的筛选,为疫苗设计和抗病毒药物开发提供了有益启示。综述了广泛应用于HIV-1 bNAbs的筛选技术和最新进展,为后续HIV-1或其他病毒bNAbs的筛选提供参考。     

HCV复制子与细胞培养体系研究进展

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染所导致的传染性肝病,呈现世界性流行态势,严重危害人类健康。由于病毒自身高度突变,以及广泛高效的细胞培养体系和合适的小动物模型缺乏,目前尚无可有效预防的疫苗。自1989年丙型肝炎病毒基因组首次被确定以来,Con1(1b)亚基因组复制子和JFH1(2a)毒株细胞培养体系相继建立。以此为工具,HCV生活周期多个关键环节得以阐明。近年来,研究者在Con1亚基因组复制子、JFH1和J6/JFH1细胞培养体系的基础上,构建出多个基因型和亚型的复制子和细胞培养体系。不同的体系在HCV复制与致病机制研究、抗病毒药物筛选方面,具有不同的用途及优缺点。针对HCV复制子与细胞培养体系的研究进展进行综述,可为HCV的相关研究提供参考。     

丙肝病毒全基因组克隆转染细胞体系的初步研究

采用一种含有HCV全基因组和噬菌体T7启动子和终止子序列的载体(pHCV)转染Vero-E6细胞,随后感染高效表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒(vTF7-3),通过vTF7-3的辅助作用,使Vero-E6细胞高效增殖HCV病毒体,建立了一种新的HCV体外细胞培养体系。RT-PCR、荧光定量PCR检测转染细胞裂解液中HCV滴度的结果显示：pHCV转染细胞内HCV基因拷贝达10^7-10^8／mL,同时有HCV正链RNA合成;免疫印迹显示该培养体系中有HCV结构蛋白、非结构蛋白的表达;pHCV转染细胞经透射电镜观察,可见清晰的HCV病毒体,直径在40-50nm。这一新体系的初步建立,为研究HCV的复制机制、制备HCV疫苗和研发抗病毒药物奠定了基础。     

丙型肝炎病毒细胞感染模型的研究进展

随着丙型肝炎病毒(HCV)的研究深入,迫切需要建立HCV体外感染模型.本文就HCV易感细胞的筛选、促进细胞生长的条件、病毒感染的影响因素,以及病毒复制标志的检测等方面作一综述.     

丙型肝炎病毒体外培养系统研究进展

由于缺少丙型肝炎病毒（HCV）的细胞培养系统和小动物模型，因此对其生活周期、作用机制至今仍不是很清楚，从而严重阻碍了丙型肝炎疫苗及相关治疗药物的开发与研制。一直以来，人们研究的HCV体外培养细胞模型包括感染模型和转染模型两种，感染模型由于原代肝细胞培养问题未能解决而难以成功，而转染模型的发展可喜。但是HCV复制子只能在极少数细胞中短暂复制，且产生的病毒量很低。1999年建立了亚基因组复制子，使人们有机会对其进行深入研究，但须人为引入碱基突变。最近建立的全基因复制子不需要引入突变即形成病毒粒子，是一项重大突破。概述了HCV体外培养系统的研究进展。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism