橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库构建及其致病缺陷转化子筛选

【目的】进一步研究橡胶树胶孢炭疽菌致病分子机理。【方法】通过含ILV1基因(具氯嘧磺隆抗性)的pSULF.gfp双元载体农杆菌AGL-1介导进行橡胶树胶孢炭疽菌遗传转化,利用氯嘧磺隆抗性标记筛选转化子,对转化子PCR验证及荧光显微观察;采用离体古铜期橡胶树叶无伤接种法进行致病性缺陷转化子筛选,并对转化子进行遗传稳定性检测。【结果】获得含3 721个转化子的T-DNA插入突变体库,转化效率为150 400个转化子/106孢子,从3 721个转化子中筛选得到致病性缺陷转化子25个;随机选取20个转化子进行遗传稳定性测定,在不含氯嘧磺隆PDA平板上继代培养10次后仍保持氯嘧磺隆抗性,且表型稳定,表明插入外源基因能够稳定遗传。【结论】可以利用根癌农杆菌介导橡胶孢炭疽菌转化,构建橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库,筛选致病缺陷突变菌,为进一步研究该菌致病相关基因提供材料。     

抗生素和干扰素

950112 由产黄,I『一生产青霉素的生物化学和分子遗传学[会,英2/Martin,J.F.I Ann.N.Y.Acad.s01.-1991,646.-132~201[译自DBA,1992,儿(13),92-07338_'] 将产黄青霉AS-P-78酰基辅酶A;6一氨基青霉烷酸一酰基转移酶纯化至均质并鉴定之。用含粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)PY r4基因和产贝菏霉pyrG基因的质粒载体作选择标记,可获得产黄青霉的高频转化。克隆、表达并测序了产黄青霉AS-P-78的异青霉素-N-合酶基因,还克隆及测序了该菌的酰基辅酶A t 6一氨基青霉烷酸一酰基转移酶和ACV-合成酶基因。产黄青霉DNA的噬菌体EMBL3基因文库…     

农杆菌介导的灰葡萄孢T-DNA插入突变体库构建及插入位点分析

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)进行转化,构建T-DNA插入突变体库,为从分子水平上认识灰葡萄孢的致病机制打下基础。【方法】以含有pCAMBIA 1390双元载体的农杆菌对灰葡萄孢进行转化,利用潮霉素进行筛选。对抗性稳定的转化子进行生物学和形态学观察,采用离体番茄叶片进行致病性测定。利用TAIL-PCR技术对突变体中T-DNA的旁侧序列进行克隆。【结果】得到了一些突变体,表现为生长速率减缓、产孢能力下降、致病力减弱等。克隆并分析了其中一个突变体中T-DNA插入的位置和旁侧序列。【结论】本实验建立了农杆菌介导的灰葡萄孢转化体系,构建了T-DNA插入的灰葡萄孢突变体库。用TAIL-PCR进行突变体中T-DNA旁侧序列的分析是可行的。     

产黄青霉转化载体pPIPKA的构建及青霉素工业生产菌株的转化研究

以腐草霉素(phleomycin)抗性为选择标记,构建了用于青霉素生产菌—产黄青霉Penicillium chrysogenum的转化载体pPIPKA。 以此转化当前的青霉素生产菌株NCPC-10086,建立了高效的工业生产菌株的基因转化体系,转化效率最高达18个转化子/g DNA。对转化子进行了PCR及Southern杂交分析,结果表明,外源基因整合到了宿主的染色体上。     

农杆菌介导的绿木霉遗传转化及重寄生缺陷突变体的筛选

绿木霉(Trichoderma virens)是一种重要菌寄生真菌,该菌已广泛应用于多种病害的生物防治上。本研究构建了双元载体pCATPH-I(GenBank登录号为：KC252999),并利用该载体成功实现了农杆菌介导的绿木霉遗传转化,转化效率可达385~460个转化子/106绿木霉分生孢子。转化子的PCR和遗传稳定性分析表明, T-DNA已整合进该菌的基因组中且在无选择压力的条件下能够稳定遗传。利用该转化体系成功建立了超过2000个转化子的转化子库,通过转化子与病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)对峙培养在该转化子库中成功筛选到两个重寄生缺陷突变体,D441和A281。本研究的完成可为绿木霉的功能基因组学及重寄生分子机制的研究打下基础。     

提高水稻插入突变体库利用效率的尝试

T-DNA标签法是一种以农杆菌介导的遗传转化为基础来创造插入突变体库, 从而高通量地分离和克隆植物功能基因的方法。但由于种种原因, 水稻插入突变体库的利用效率较低。为了提高水稻插入突变体库的利用效率, 结合水稻一个双拷贝T-DNA插入突变体的发现和鉴定研究, 通过特异PCR检测、侧翼序列与目标性状的共分离分析, 在1个双插入位点均为杂合的植株的后代株系中分拆了2个插入事件, 分离出目标性状存在遗传分离且只带有1个插入事件的后代株系, 为后续的共分离检测和基因克隆研究打下了重要的基础。由此产生了对插入突变体库中的非串联多拷贝插入标签系进行研究的一些思路和方法, 提出来与同行商榷。     

产黄青霉工业生产菌种基因报告系统的构建及启动子效率的评价

本研究以四种不同物种来源,不同代谢途径功能基因的启动子为材料,分别构建了以产黄青霉异青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的启动子Pipns、构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子PgpdA、构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子PtrpC、粗糙脉胞霉氨基酸合成交叉途径控制基因cpc的启动子Pcpc为启动子,腐草霉素(phleomycin)抗性基因为报告基因,构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的终止子TtrpC为终止信号的丝状真菌转基因质粒,建立了产黄青霉工业生产菌种启动子筛选、评价体系,调查了这四种启动子的强弱。结果表明选择性标记基因受强启动子驱动可以提高产黄青霉工业生产菌种的转基因效率。研究也显示这四种启动子的强弱的顺序为PgpdA、Pcpc、Pipns和PtrpC。     

菰黑粉菌T-DNA突变体库的构建及分析

通过建立适用于菰黑粉菌Ustilago esculenta的农杆菌介导遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)体系,构建菰黑粉菌T-DNA插入突变体库。针对性地筛选双核菌丝形成缺陷型转化子,并对T-DNA插入位点进行分析,为研究菰黑粉菌二态型转换的分子调控机理打下基础。以构建的菰黑粉菌自融合菌株TSP为出发菌株,以含有遗传霉素(G418)抗性基因(neo)的质粒为载体,通过ATMT构建菰黑粉菌T-DNA突变体库,并对诱导剂乙酰丁香酮(AS)浓度、转化的共培养时间、农杆菌浓度和菰黑粉菌芽孢子浓度等建库影响因素进行单因素条件试验,筛选最优条件;对继代培养的转化子基因组中的遗传霉素抗性基因进行PCR检测,验证转化子遗传稳定性;对突变体库中的转化子双核菌丝生长情况进行观察,测定其双核菌丝形成能力;对上述双核菌丝形成缺陷型转化子进行基因组重测序,分析其T-DNA插入位点。当遗传霉素浓度为75μg/mL时,菰黑粉菌的生长被完全抑制。当AS浓度为100μg/mL、共培养时间为24 h、孢子浓度为1×10⁵     

快速筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因的方法

阐明拟南芥受精和早期胚胎发生过程对理解被子植物生殖发育有着重要的指导意义,而利用正向遗传学方法研究拟南芥突变体的表型及其分子机理是探究植物基因功能最常用的一种方法。基于常规的插入突变(包括T-DNA和转座子)、化学诱变(如ethylmethane sulfonate,EMS)和高能射线方法构建的突变体库中假阳性突变体多,难以高效筛选到受精和早期胚胎发生相关基因的突变体。为解决这一难题,本研究建立了一种构建T-DNA插入突变体文库的新方法。即在载体p CAMBIA1302的T-DNA元件上增加花粉特异荧光标记基因(p LAT52∷EGFP),并遗传转化具有四分体花粉的Columbia野生型拟南芥突变体qrt1-2;对获得的突变体库可利用花粉荧光快速排除假阳性突变体,并采用反向PCR(inverse-PCR)扩增技术确定突变位点。此方法在筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因突变体上的成功应用表明,其是一种效率高、针对性强、操作相对快捷方便的拟南芥突变体筛选方法。     

T-DNA介导的基因诱捕技术及其在植物功能基因组学研究中的应用

T-DNA介导的基因诱捕技术是近年来发展起来的鉴定和分离基因的方法。在拟南芥和水稻基因组测序已经完成的今天, 该技术将在两者基因功能的研究中扮演举足轻重的角色。本文就T-DNA介导的基因诱捕系统、 基因克隆和突变体库构建的研究进展及其在植物功能基因组学上的应用等内容进行了综述, 并讨论了该技术应用中的一些问题。     

烟曲霉突变体库的构建及伊曲康唑耐药菌的筛选

目的构建烟曲霉突变体库并筛选耐药突变子,初步探讨烟曲霉的耐药机制。方法利用根瘤农杆菌T-DNA介导的插入突变构建烟曲霉突变体库,用伊曲康唑对突变体库进行筛选,挑取烟曲霉耐药突变株。结果利用根瘤农杆菌T-DNA插入突变,本研究获得了1805株突变子,诊断PCR显示突变子基因组DNA上均含有潮霉素标记,说明T-DNA均插入到了宿主的基因组上。通过筛选,本研究成功获得了16株烟曲霉伊曲康唑耐药菌,其中有两株对两性霉素B表现为不同程度的耐药性。结论通过构建烟曲霉突变体库以及耐药突变子筛选获得了16株烟曲霉耐药菌,为进一步研究烟曲霉的耐药机制奠定了基础。     

农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌株

建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法及T-DNA突变库,高效筛选聚苹果酸高产菌株及功能基因。通过含潮霉素和草铵磷抗性基因的农杆菌转化出芽短梗霉,抗性压力筛选及PCR验证建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法,结合发酵液p H与聚苹果酸含量响应变化,微孔板高效筛选高产聚苹果酸的T-DNA插入突变株,基因组步移确定T-DNA插入位点及功能基因。结果获得遗传稳定的抗性基因菌株,每107个细胞可获得80-120个转化子,出芽短梗霉H27号T-DNA突变株聚苹果酸摇瓶发酵产量提高24.5%,基因组步移证实糖酵解途径磷酸甘油酸变位酶基因被破坏。成功建立了根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法和T-DNA插入突变库,结合高效筛选方法为聚苹果酸合成功能基因挖掘及高产机制解析奠定基础。     

有害疣孢霉Hypomyces perniciosus遗传转化体系的建立及其突变体库的构建

有害疣孢霉Hypomyces perniciosus是引起双孢蘑菇Agaricus bisporus湿泡病的病原真菌,目前其致病分子机理尚不清楚,而高效稳定的遗传转化体系和突变体库构建是挖掘和研究病原菌致病基因的基础和有效手段。因此,本实验以高致病力的有害疣孢霉菌株WH001为研究对象,采用冻融法将双元载体pBHt1转入农杆菌AGL-1中,建立并优化根癌农杆菌介导的遗传转化体系,并利用其构建T-DNA插入突变体库。结果表明有害疣孢霉菌株WH001的潮霉素（Hygromycin,Hyg）耐受浓度为250ng/L,当农杆菌侵染液浓度OD₆₀₀=1,侵染时间为30min,乙酰丁香酮（Acetosyringone,AS）浓度为1.5mg/mL,共培养时间为3d时,转化体系效率最高。然后利用该优化体系构建有害疣孢霉的突变体库,通过PCR检测和形态学鉴定获得若干表型发生改变、稳定遗传的T-DNA插入突变体,与原菌种WH001相比,突变体在菌丝形态、生长速率、色素分泌和致病力等方面发生改变。本研究为进一步挖掘有害疣孢霉未知基因功能、解析生物学性状、探讨致病分子机制奠定基础。     

根癌农杆菌介导的转新城疫病毒融合蛋白基因水稻植株的获得

利用转基因植物作为生物反应器可以表达重组蛋白、生产外源蛋白质,也可以成为动物疫苗的廉价生产系统。以编码新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)的基因为外源基因,以玉米泛素蛋白(Ubi)启动子为启动子,以潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因作为选择标记基因,β-半乳糖苷酸酶(GUS)基因作为报告基因构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的表达质粒pUNDV,并通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株。通过PCR分析和GUS活性检测,证实含有NDV-F基因的T-DNA已整合到水稻核基因组中,为研制廉价安全的转基因水稻新城疫基因工程疫苗奠定了基础。     

甘蔗梢腐病串珠镰孢菌T-DNA插入突变体的构建及其鉴定分析

甘蔗梢腐病是世界范围内重要的经济作物真菌性病害,其病原真菌为串珠镰孢菌(F.moniliforme)。通过农杆菌介导的遗传转化构建了串珠镰孢菌(菌株CNO-1)的突变体库,并通过Hi TAIL-PCR和菌落形态对突变体库进行鉴定。结果构建了库容量为956的CNO-1突变体库。从CNO-1突变体库中随机挑选6个转化子,进行PCR鉴定,结果均为阳性。CNO-1突变体库中,筛选出生长速度减慢突变体22个,色素变异突变体1个;对47株突变体进行Hi TAIL-PCR,扩增插入位点侧翼序列,得到有效序列22条,BLAST结果显示,T-DNA的22个插入位点分布在CNO-1的15条基因组scaffold上;生长速度减慢突变体的插入失活基因分别与细胞分裂、DNA修复、△12脂肪酸脱氢酶、E3泛素连接酶等有关。     

农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式

农杆菌介导的遗传转化已被广泛应用于植物转基因研究。作为外源基因的载体,农杆菌T-DNA片段在植物基因组中的整合方式,不仅影响外源基因的整合效率及稳定性,还会影响外源基因的表达特性。文章就农杆菌介导的T-DNA整合的两种主要模式、规律及相关研究手段进行综述,为农杆菌介导的转基因及T-DNA插入突变等相关研究提供借鉴。     

香菇印gpd-Le和ras-Le启动子的功能分析

利用从香菇菌丝体中克隆的启动子片段gpd-Le(613bp)和ras-Le(715bp)分别连接于报告基因gfp(绿色荧光蛋白基因)的上游,构建了启动子功能活性检测表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp分别与辅助质粒pCc1001(含有trp1基因)共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测。结果表明:香菇gpd-Le启动子在灰盖鬼伞的菌丝中具有较强驱动外源gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察到gfp基因表达的绿色荧光。而香菇ras-Le启动子没有检测到有驱动外源gfp基因表达的活性。     

家蚕转基因方法的初步研究

为建立家蚕转基因研究中切实可行的外源基因导入方法、分别用显微注射法、精子介导法、脂质体法和压力渗透法将含有绿色荧光蛋白(gfp)基因的转座子载体和辅助质粒转入到家蚕的受精卵中。在后代中检测到发绿色荧光的蚕茧,用PCR方法检测到后代个体染色体中含有gfp基因,并比较了上述几种方法的优缺点,为进一步进行转基因家蚕的研究奠定了基础。     

几种基因随机突变方法在"外源基因全序列结构优化"表达研究中的效率比较

“外源基因全序列结构优化”是依据外源基因序列结构是影响其在大肠杆菌中表达的重要因素,而提出的一种新的实现外源基因在大肠杆菌中高效表达的策略。该策略包括以下几个步骤:1目的基因全序列变异文库的构建;2利用高通量表达筛选载体从变异文库中筛选表达突变体;3表达突变体的鉴定和表达研究。其中,变异文库的构建方法和性质对研究的结果有着重要的影响。变异文库的构建可有多种方法,其中低频率的随机突变方法是一重要的类型。为了探索最适合突变的方法,我们以HIV-1gp120-801基因为模型、选用了一组基于PCR技术的基因随机突变技术用来构…     

含gfp植物转基因表达载体的构建及在矮牵牛转基因不定根中的高效表达

利用pBIN19、pGFP和pCHS质粒, 成功构建了CaMV 35S启动子驱动的gfp基因的植物转基因表达载体pBIN-35S-GFP, 并导入野生型发根农杆菌K599。矮牵牛的转化实验表明, 矮牵牛离体叶片被发根农杆菌K599(带pBIN-35S-GFP质粒)感染生根率达45%。对诱导的不定根基因组DNA的PCR检测表明, 不定根基因组中含有发根农杆菌K599 Ri质粒中的rolB基因和外源gfp基因;转基因不定根在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光, 表明构建的转基因载体pBIN-35S-GFP能实现gfp基因的高效表达。该载体在CaMV 35S启动子的两端各有一个多克隆位点, 可以方便地进行启动子替换, 用于研究不同启动子的功能。此外, 该载体在gfp基因的5'端含有多克隆位点, 在3'端含有EcoRⅠ和BsmⅠ两个单一酶切位点, 可以方便地在5'端连接上目标基因, 表达含GFP的融合蛋白, 进行目标基因编码蛋白的亚细胞定位; 也可以方便地切除gfp基因, 连上需要的目的基因进行转化。