产黄青霉的杂交育种

选育高产菌株是工业微生物提高产量最有 效的方法。我们于1974-1977年,对产黄青霉 (Penicillium clirysogenusn)采用杂交育种和诱变 育种相结合的方法,选得了一株高产菌株杂 3-25-103,从1977年开始用于生产。该菌株在 20吨和58吨罐试验共229批,与同期对照菌 利“相比,青霉素发酵单位平均提高8%。青霉素 滤液产量比1976年同期提高6.45%。     

一种适合PCR反应的产黄青霉基因组简易提取方法

为同时高效地对大量产黄青霉(Penicillium chrysogenum)突变株进行分子鉴定,本实验探索了一种适合PCR反应的简易产黄青霉基因组提取方法。该方法首先将产黄青霉菌丝转移至0.7 mol/L Na Cl为等渗剂的蜗牛酶(6 mg/m L)和纤维素酶(4 000 U/m L)酶解液中,超声波处理10 min,然后于28℃酶解14 h,最后95℃加热处理10 min。结果表明,应用该方法获得的裂解液上清稀释后可直接作为PCR反应模板,且扩增条带清晰。该方法操作简便,用样量小,可在96孔板一个孔中完成DNA模版的制备过程,并且可同时并行多个样品,适于大规模产黄青霉基因工程突变株的检测,并为其它真菌基因组的提取提供了参考。     

一种快速构建基因多个点突变体方法的建立

蛋白质内部多个位点的翻译后修饰在基因的功能调节过程中发挥重要作用,基因的点突变体在其结构和功能研究中发挥非常关键的作用,因此,高效、快速构建基因的多个点突变体在基因的功能研究中意义重大．本研究在建立了对目的基因进行高效准确的单点突变方法的基础上,以SRrp53点突变体的构建为例,设计了新型的以反向PCR为基础的多个点突变的实验流程,获得的多位点突变体质粒经测序后均与预期相符,将测序正确的多位点突变体质粒转染293T细胞后,均表达了分子质量正确的蛋白质．以上结果表明,该实验设计方案能够高效、方便地用于基因多个点突变体的构建,为进一步研究它们的分子功能打下了基础．     

非生长产黄青霉吸附铅的研究

本文报道非生长产黄青霉(Penicillium chrysogenum)对溶液中铅离子的吸附。菌体对铅的吸附依赣于溶液的pH值,在pH4-5范围内,其饱和吸附量(116mgPb2+／g干菌)高于活性炭及文献中所报道的蕈状芽抱仟菌(Bacillus mycoidrs),小刺青(Penicillium spinulosum)及长木链霉(Streptomyces longwoodensis)等。当pH4．5时,产黄青霉对铅的选择性高于Zn2+、Cd2+,Cu2+和As3+Cu2+、As3+的存在对铅的吸附无明显影响。Cd2+的存在使铅的吸附量有所提高．而Zn2+的存在则使之降低。在小试规模下,经本法处理过的含铅工业废水,铅含量降至1.0mg／1．以下,达到国家规定的工业废水铅含量的排放标准。     

产黄青霉工业生产菌种基因报告系统的构建及启动子效率的评价

本研究以四种不同物种来源,不同代谢途径功能基因的启动子为材料,分别构建了以产黄青霉异青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的启动子Pipns、构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子PgpdA、构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子PtrpC、粗糙脉胞霉氨基酸合成交叉途径控制基因cpc的启动子Pcpc为启动子,腐草霉素(phleomycin)抗性基因为报告基因,构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的终止子TtrpC为终止信号的丝状真菌转基因质粒,建立了产黄青霉工业生产菌种启动子筛选、评价体系,调查了这四种启动子的强弱。结果表明选择性标记基因受强启动子驱动可以提高产黄青霉工业生产菌种的转基因效率。研究也显示这四种启动子的强弱的顺序为PgpdA、Pcpc、Pipns和PtrpC。     

产黄青霉转化载体pPIPKA的构建及青霉素工业生产菌株的转化研究

以腐草霉素(phleomycin)抗性为选择标记,构建了用于青霉素生产菌—产黄青霉Penicillium chrysogenum的转化载体pPIPKA。 以此转化当前的青霉素生产菌株NCPC-10086,建立了高效的工业生产菌株的基因转化体系,转化效率最高达18个转化子/g DNA。对转化子进行了PCR及Southern杂交分析,结果表明,外源基因整合到了宿主的染色体上。     

产黄青霉ds RNA病毒通过原生质体融合的转移

将国内青霉素产生菌(Penicillium chrysogenum)的黄孢子系统及绿孢子(包括淡绿,灰绿)系统的十多个菌株,经过病毒提取、电镜观察、奥氏免疫双扩散、凝胶电泳及放射免疫测定,证明黄孢子系统的菌株含有不同滴定度的、直径40nm的球形病毒,而绿孢子系统中检查不出病毒。从营养要求、孢子颜色不同的带病毒和无病毒菌体中分离原生质体,进行不同组合的原生质体的融合杂交,获得营养互补融合的异核体。异核体1中,病毒通过胞质融合转移到原来无病毒的灰绿孢子菌株及细胞核融合后的杂合二倍体中。灰绿孢子的病毒量接近二倍体的1/3。二倍体菌落生长稳定,低温保存二年后经0.01—0.02M对氟苯丙氨酸(PFA)诱发和分离,产生亲本类型的分离子,分离子及二倍体仍然含有病毒。异核体2作亲本性分离,黄孢子仍有病毒,淡绿孢子及细胞核融合后产生的二倍体均无病毒,表明非感染性为显性。此种淡绿孢子的突变体中存在非感病菌系,它不支持病毒的复制。提取各杂交组二倍体内的病毒所特有的dsRNA时,可看出dsRNA的存在和病毒的存在一致。多数杂合二倍体的青霉素产量比亲本高。     

一种快速简单的质粒DNA纯化方法

本文介绍一种快速获取高纯度质粒DNA的方法。本法对煮沸提取法进行改良后,快速提取质粒DNA粗制品,然后用国产滤纸从琼脂糖凝胶中回收纯化质粒DNA。同时对本法所提取的质粒DNA的回收率、浓度、纯度及可能的用途进行验证和讨论,证明此法简易,所得样品纯度高,可直接用于转化、酶切和基因克隆。     

一种简单、快速提取DNA的方法

随着分子生物学研究的迅速发展,提取ＤＮＡ已成为一项常规实验。用经典方法提取ＤＮＡ［１］,先用蛋白酶Ｋ、ＳＤＳ消化,然后用酚、氯仿抽提,乙醇沉淀,耗时较多,提取液需要多次转移,易引起交叉污染和ＤＮＡ丢失。本文利用硅藻（ｄｉａｔｏｍ）能够特异性吸附核酸的...     

糜子EMS突变体库构建和突变体筛选

糜子(Panicum miliaceum L.)具有抗旱、耐瘠、适应性广、生育期短等特点,是我国北方地区的杂粮作物。糜子高产品种不耐水肥、易倒伏,锄草、间苗费时费工的问题严重影响着农民对糜子生产的积极性和收入。EMS(甲基磺酸乙酯)化学诱变方法成本低,操作简单,诱变率高,是作物育种的重要方法。本试验选用糜子品种伊选大红糜进行EMS化学诱变而构建突变体库,对获得的2333个M2材料进行突变频率和全生育期表型多样性等特征的分析。结果显示,所构建的糜子突变体库材料变异类型非常丰富,共发现104个形态性状突变株系,突变频率为4.5%,包括叶色、叶型、株高、生育期、育性、穗型、种皮颜色等性状,该突变体库的构建将为糜子功能基因组学研究和育种提供丰富的突变体资源和新型种质。     

产黄青霉病毒的稳定性和体内病毒的滴定度

产黄青霉(penicillium chrysogenum)病毒(PcV)在0.02M、pH 7.0磷酸缓冲液(4℃)中经乙醚、氯仿、0．1％SDS、甲醛等处理和一20℃冻融及4℃下保存230天以上均仍保持抗原性。但用0．5一1％SDS处理和5次以上反复冻融便全部丧失或只保留极微弱的抗原性。随着保存时间延长抗原性逐渐降低,在凝腔电泳中两区带间隔和迁移率明显增加。     

一种简单快速植物组织冰冻切片方法

比较不同冷冻方法对植物细胞超微结构的影响,结果表明:直接包埋法处理的植物细胞超微结构保存较好,而液氮冷冻处理的植物细胞内膜系统损伤严重.建立了一种直接包埋冷冻和适当回温相结合的方法,不仅可以制作出植物细胞基本结构保存完整的组织切片,而且避免了使用冰冻保护剂的弊端.其操作程序是:样品固定→冰冻与包埋→适当回温→快速切片→展片→染色.此法制作的切片可进行不同的染色和组织细胞化学测定,具有操作简便,易于推广的特点.     

一种简单快速的拟南芥水培方法的研究

利用１／４ Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液为营养液,采用空气压缩机通气,光照度１２０μｍｏｌ／ｍ＾２／ｓ,光暗周期１２／１２小时,光照温度２２℃,黑暗温度１８℃,湿度５０％,对模式植物拟南芥进行了溶液培养。采用这种水培系统培养的拟南芥植株比土培的植株提前三周成熟,而且植株生长非常健壮,苗高可达３０～４０ｃｍ。     

一种快速筛选产琥珀酸厌氧菌的方法

为筛选得到高产琥珀酸的厌氧菌株,建立了一种快速半定量分析发酵液中琥珀酸的方法。首先通过高效液相色谱法(HPLC)分析出产琥珀酸厌氧菌发酵液中主要含有琥珀酸,乳酸和乙酸,然后将发酵液经过纸层析展开后,发现琥珀酸可以和副产物乳酸,乙酸完全分开,最后用半定量的方法求出琥珀酸的含量。结果表明纸层析法简单经济,可以作为产琥珀酸厌氧菌的初筛方法。     

产黄青霉谷胱甘肽S-转移酶基因PcgstA的克隆与鉴定

从青霉素工业生产菌产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)中首次克隆了一个谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因,定名为PcgstA.该基因的开放阅读框长840bp,含有两个内含子,编码一个238氨基酸残基的蛋白质.其推断的氨基酸序列与一些已经鉴定的丝状真菌GST具有50%左右的序列一致性.PcgstA的完整编码区经RT-PCR扩增、验证,插入原核表达载体pET11a,转化大肠杆菌BL21(DE3)-RP菌株,表达得到重组PcGSTA蛋白.酶活测定证实,重组PcGSTA具有GST活性,其对底物CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene)的比活为(0.159±0.031)μmol/(min·mg).利用TaqMan探针法,对PcgstA的表达情况进行了比较.结果表明,在添加了侧链前体苯乙酸的青霉素生产培养基中,PcgstA的表达水平和在不含苯乙酸培养基中的表达相比明显下调,显示了该基因与苯乙酸代谢的关系.     

产黄青霉d8RNA病毒通过原生质体融合的转移

将国内青霉素产生菌(Penicillum chrysogenum)的黄孢子系统及绿孢子(包括淡绿,灰绿)系统的十多个菌株,经过病毒提取、电镜观察、奥氏免疫双扩散、凝胶电泳及放射免疫测定,证明黄孢子系统的菌株含有不同谪定度的、直径40nm的球形病毒,而绿孢子系统中检查不出病毒。从营养要求、孢子颜色不同的带病毒和无病毒菌体中分离原生质体,进行不同组合的原生质体的融合杂交,获得营养互补融合的异核体。 异核体1中,病毒通过胞质融台转移到原来无病毒的灰绿孢子菌株及细胞核融合后的杂合二倍体中。灰绿孢子的病毒量接近二倍体的l／3。二倍体菌落生长稳定,低温保存二年后经0.01—0.02M对氟苯丙氨酸(PFA)诱发和分离,产生亲本类型的分离子,分离子及二倍体仍然含有病毒。异核体2作亲本性分离,黄孢子仍有病毒,淡绿孢子及细胞核融合后产生的二倍体均无病毒,表明非感染性为显性。此种淡绿孢子的突变体中存在非感病菌系,它不支持病毒的复制。提取各杂交组二倍体内的病毒所特有的dsRNA时,可看出dsRNA的存在和病毒的存在一致。多数杂合二倍体的青霉素产量比亲本高。     

一个新的产黄青霉谷胱甘肽转移酶基因的克隆和鉴定

以产黄青霉(Penicillium chrysogenum Thom)cDNA为模板,克隆得到一个新的谷胱甘肽转移酶基因PcgstB,其开放阅读框长651bp,编码216个氨基酸的蛋白质。与已知序列进行BLASTp比较显示,该蛋白具有保守的GST结构域,与烟曲霉GstB的序列一致性最高,达65%。将PcgstB与原核表达载体pTrc99A连接得到表达质粒pTrc-gstB,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导后获得以可溶形式表达的重组PcGstB蛋白。以1-chloro-2,4-dinitrobenzene(CDNB)为底物检测,确认该蛋白具有GST活性。     

一种用少量标本快速构建老年性白内障消减cDNA文库的方法

为从少量标本中获得含较多大片段的、高质量的老年性白内障消减cDNA文库,利用磁珠分离、生物素标记的改良消减杂交法获得差异cDNA,利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA,从而成功构建老年性白内障消减cDNA文库.在文库中随机挑取的22个克隆中,1 000 bp以上的片段有7个,占31.8%,750 bp以上有15个,占68.2%.所得cDNA片段较大,可以满足下一步研究需要.改良消减杂交法结合选择性PCR法可以从少量标本中快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库.     

罗布麻EMS突变体库构建及黄酮变异突变体筛选

罗布麻(Apocynum venetum L.)突变体的获得是人工创新种质资源的有效途径,也是开展品种选育、功能基因组研究的基础。本研究以采自东营野生罗布麻种子作为材料,预试验结果表明0.7%的甲基磺酸乙酯(EMS,ethylmethylsulfone)溶液诱变罗布麻种子13 h能够达到半致死剂量。在此浓度和处理时间下构建了一个1452株的突变体群体,对获得的M1植株进行农艺性状和总黄酮含量性状筛选,初步获得125份农艺性状突变材料,其中包括8株白化植株、23株叶型变异株、16株叶色黄纹突变体、32株苗期分枝植株以及46株叶位变异突变体,突变频率分别为0.55%、1.6%、1.1%、2.2%和3.2%。此外,还筛选到2株总黄酮含量明显高于野生型和1株低于野生型的材料。在突变群体中对黄酮代谢途径中编码黄烷酮-3-羟化酶的基因(F3H,flavanone 3-hydroxylase gene)进行测序鉴定,结果鉴定到3株F3H基因的突变体。本研究构建的罗布麻突变体库表型丰富且突变位点可以鉴定,是罗布麻新种质筛选、品种选育以及基因功能研究的良好材料。     

展青霉和产黄青霉种间体细胞杂交 Ⅱ.病毒通过原生质体融合的传递

具有直径40毫微米球形病毒(PcV)的产黄青霉和有杆状病毒(PpV1)及26—29毫微米球形病毒(PpV2)的展青霉通过原生质体融合杂交,获得杂种及分离子。电镜、血清反应、凝胶电泳检验病毒表明:(1)病毒的传递受到寄主基因组的影响,在杂种及分离子中PcV的大量出现总是伴随着产黄青霉整套基因组的存在。(2)感染同一寄主时不同的真菌病毒间存在着类似植物病毒的交互保护作用。本文是dsRNA真菌病毒通过真菌种间融合转移的首次报告。杂种及部分单倍体重组子具有抗葡萄球菌Staphylococcus attrcus和抗链格孢Alternaria (?)p.的能力。