草莓MET1基因启动子克隆及瞬时表达分析

根据草莓MET1类DNA甲基转移酶基因(FaMET1)全长序列设计引物,通过PCR获得了该基因翻译起始位点上游669 bp的序列.生物信息学分析表明,该序列中存在启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box和多个胁迫诱导元件.进一步构建了FaMET1基因启动子驱动GUS的植物表达载体FMpro::GUS,通过农杆菌注射法转化草莓果实细胞,结果表明,该序列能够驱动GUS在草莓果实中瞬时表达,为进一步研究FaMET1的表达调控奠定了基础.     

人天然免疫基因BCL10的猪同源物的识别、克隆与初步表达分析

采用电子克隆方法克隆到大小为925 bp的人天然免疫蛋白BCL10的猪同源基因完整cDNA序列(GenBank登录号：EU088132), 并利用RT-PCR方法从猪的全血中扩增出包含702 bp的完整开放读码框架(ORF)的cDNA片段。经核酸测序, 证明与电子克隆结果相符。利用NCBI BLAST分析该cDNA包含3个大小为57 bp、289 bp和356 bp的外显子, 并且定位于猪的4号染色体上。采用半定量PCR技术检测基础水平猪各组织BCL10基因mRNA表达丰度, 并将该基因构建到带有绿色标签的真核表达载体pEGFP-C1中, 采用脂质体转染法将该基因转入PK-15细胞, 通过绿色荧光标记和RT-PCR方法检测实验组的BCL10蛋白表达。研究结果表明, BCL10基因mRNA在脾脏中表达最高; 胸腺、大脑和淋巴结表达次之, 而肝脏只有微量表达, 肾脏没有检测到表达; 同时BCL10基因在PK-15细胞中得到了有效表达。     

草莓APETALA2同源基因的克隆及表达分析

利用同源克隆方法首次从草莓花芽cDNA中分离出APETALA2同源基因SAP2。SAP2全长182bp,编码435个氨基酸。序列分析表明,SAP2具有AP2家族典型的结构域。采用RT-PCR方法分析SAP2在不同组织中的表达情况,结果显示SAP2在草莓营养组织、花芽以及不同花器官中均有表达,与拟南芥AP2、矮牵牛PhAP2A的表达模式一致。以上结果说明SAP2是草莓的AP2同源基因。     

草莓果实钾载体蛋白基因的克隆与序列分析

本文用RT-PCR的方法,首次从草莓幼果RNA中成功扩增出KUP/HAK/KT转运体基因的部分序列,经过克隆测序得到了1个长度为1252bp基因片段,编码416个氨基酸.经过与其他物种KUP/HAK/KT转运体基因序列比较相似率在70%～78%之间,氨基酸相似性在72%～88%之间.草莓KUP/HAK/KT转运体基因的成功克隆,为草莓抗褐变的研究及草莓钾元素营养代谢分子水平上的研究及果实品质的改良打下坚实的理论基础.     

草莓FaWRKY70克隆与表达模式分析

【目的】深入解析WRKY70同源基因在草莓响应胁迫过程中的作用,为草莓分子育种提供新的基因资源。【方法】采用同源克隆法从草莓果实及叶片中克隆得到草莓WRKY70基因,利用生物信息学分析方法分析该基因理化性质、蛋白质结构、进化关系等,并结合qRT-PCR数据分析其表达模式。【结果】FaWRKY70基因全长为1 020 bp,编码339个氨基酸;比对得到的同源基因中,FaWRKY70与苹果、牡丹等同科物种氨基酸序列相似度较高,且同源基因大多与植物对生物和非生物胁迫的响应相关,暗示FaWRKY70可能参与草莓抵御胁迫的过程;FaWRKY70在草莓的花、果实、叶片、根、茎中均有表达,在花中表达量最高,果实中最低;在水杨酸处理后,FaWRKY70基因能够快速响应,表达量在3 h后达最高,随后逐渐降低。使用茉莉酸甲酯处理时FaWRKY70基因受诱导响应程度较小,整体呈现下调趋势。【结论】FaWRKY70能通过不同响应方式参与草莓生命活动及激素信号转导过程。     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的克隆与表达

目的:构建人IL-10原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法:应用RT-PCR技术从ConA诱导的单核细胞中扩增出IL-10成熟肽cDNA片段,将其克隆到PGEM-T后载体测序,双酶切回收目的片段构建IL-10原核表达载体PET28a-IL10。PET28a-IL10转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后对其表达产物进行SDS-Page和Western Blot分析。结果:SDS-Page电泳显示IL-10在大肠杆菌中得到了表达,分子量为21000,Western Blot分析显示表达产物可于IL-10多抗特异反应。结论:IL-10在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。为其进一步生物学研究奠定了基础。     

双须骨舌鱼卵黄蛋白原基因vtg的克隆、组织表达和原核表达分析

为探究双须骨舌鱼(Osteoglossum bicirrhosum)卵黄蛋白原vtg基因的结构和表达特征,本研究运用RACE技术克隆双须骨舌鱼vtg全长c DNA序列。序列分析发现,双须骨舌鱼vtg的c DNA全长为5 325 bp,开放阅读框(ORF)为5 121 bp,其5′和3′非编码区(UTR)分别为46 bp和159 bp,共编码1 706个氨基酸,预测蛋白质分子量约为186.79 ku。同源性分析发现,双须骨舌鱼与同科的美丽仆骨舌鱼(Scleropages formosus)相似度达到84.78%,与鲤形目、鲈形目、鲱形目、鲽形目鱼类的相似度均高于50%。系统进化树分析结果显示,本文获得的双须骨舌鱼vtg基因与骨舌鱼目聚为一类,与鳗鲡目硬骨鱼类亲缘关系较近,与双须骨舌鱼进化地位相符。荧光定量PCR检测结果表明,在雌雄鱼性腺和肝中vtg均有表达,且在雌鱼肝中的相对表达量显著高雄鱼(P0.05),卵巢和精巢表达量无显著差异(P0.05);在雌雄鱼鳃、脾、肾、肌肉、心、头肾、脑等7个组织中均极微量表达,且无显著差异(P0.05)。在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期卵巢中vtg相对表达量依次增加,Ⅳ期显著高于Ⅱ和Ⅲ期(P0.05),也显著高于精巢Ⅳ期(P0.05);在雌鱼肝组织中呈先增后减趋势,且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期之间无显著差异(P0.05),但每个时期都显著高于雄性(P0.05)。成功构建了原核表达载体p EASY-Blunt E2-vtg,并转入Transetta(DE3)表达感受态细胞中成功诱导出融合蛋白。Western-blotting检测显示,融合蛋白可被抗His标签特异性识别。综上表明,vtg表达水平高低与性别相关,并与性腺发育程度有关。此外,本研究结果也为后续深入研究卵黄蛋白原的生理功能打下基础。     

野生种马铃薯SpPHYB基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从野生种马铃薯中克隆到一个光敏色素基因PHYB,其cDNA全长为3470bp。含有一个3393 bp的完整开放阅读框,编码一条长1130个氨基酸的蛋白,分子量为125kDa,等电点为5.6。该基因编码的蛋白序列与栽培种马铃薯、番茄和烟草同源基因编码的氨基酸序列一致性分别为98%、95%、92%,命名为SpPHYB.半定量PCR分析表明,根、茎、叶和芽中SpPHYB表达水平较高且相似,但在花和块茎成熟器官中表达量稍低.     

红肉猕猴桃DFR基因的克隆及表达分析

利用葡萄(Vitis vinifera)果实的DFR-cDNA序列搜索猕猴桃(Actinidia Lindl.)EST数据库,拼接所有与该cDNA相似片段成contig并借此设计引物,分离出红肉猕猴桃(A.chinensis var.rufopulpa)中DFR的两个克隆(AcDFR1和AcDFR2)的片段。在此基础上利用5′RACE和3′RACE技术,分别克隆到具有完整阅读框的AcDFR1(1264 bp)和靠近3′端的部分AcDFR2序列(880 bp)。AcDFR1与茶DFR-cDNA(Camellia sinensis)相似达84%,且AcDFR1与非洲菊变种(Gerbera hybrida var.regina)的氨基酸序列相似达80%。据DFR聚类分析,AcDFR1与AcDFR2蛋白类型上差异显著。实时定量PCR分析表明,AcDFR1在‘金魁'(A.chinensis var.deliciosa‘Jinkui')中表达很高,AcDFR1和AcDFR2在‘金农'(A.chinensis var.chinensis‘Jinnong')与‘红阳'(A.chinensis var.chinensis‘Hongyang')中较低,且在果实发育后期(大约花后90～120 d)均有所升高,二者可能参与了红肉猕猴桃中花青素的积累,而在绿肉猕猴桃‘金魁'与黄肉猕猴桃‘金农'中,AcDFR1可能还参与了类黄酮代谢过程中的上游分支途径。     

催乳素A基因的克隆与表达

用PCR和限制性酶酶切方法将CS-A基因克隆到表达载体pCDGFP中,用免疫沉淀和Western blot的方法检测转染后的表达以及表达产物在细胞中分布。结果表明表达产物的分子量与预测的一致,而且证明CS-A是一个分泌蛋白;荧光显微镜观察表明CS-A蛋白分布于细胞质中。     

草莓果实MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

根据多种植物MADS-box基因保守区序列设计简并引物,应用PCR技术从草莓绿果中分高出33条MADS-box基因cDNA片段.序列分析表明,这些片段长度在137 - 146 bp之间,包含基因起始密码子.推导的氨基酸序列与已登录的草莓的MADS-box基因同源性超过87％.推导的氨基酸序列与已知的革莓和其他物种调控果实发育成熟的MADs-box基因以及拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析,可将这些基因片段分科归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,证明草莓果实中存在各类MADS-box家族基因,克隆的部分片段可能参与调控果实发育和成熟软化的调节.     

福建漳州设施栽培草莓品种引种筛选

在福建漳州引进6个草莓品种进行设施栽培,通过对比分析,筛选出2个适宜该地区设施栽培的品种——‘法兰地’和‘红宝’。‘法兰地’具早熟的特点;‘红宝’产量高,达25561.8 kg·hm-2;两者适应性强,口感好,受欢迎度高,适合漳州地区发展设施栽培与观光采摘。     

草莓叶绿素荧光参数日变化的研究

以草莓（Fragaria ananassa Duch）为材料,研究其叶片叶绿素荧光参数的日变化。在自然光下,草莓叶片的最大荧光（Fm）、PSⅡ光化学效率（Fv／Fm）、PSⅡ光量子效率（Yield）和光化学猝灭系数（qP）从6：00-18：00均先下降后上升,其中在下午14：00最低;而非光化学猝灭系数（qN）先上升后下降,其中在下午14：00最高。表明在中午强光下,草莓叶片遭受了强烈的光抑制,而热耗散是其主要的光保护机制。     

组织培养导致的草莓DNA甲基化变异

以草莓品种‘丰香’和‘全明星’为材料,用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术研究组织培养对草莓DNA甲基化的影响。结果表明,与普通苗相比,组织培养导致草莓试管苗的DNA甲基化水平下降,甲基化模式的变异以去甲基化为主。组织培养导致的DNA甲基化变异不稳定,在田间无性繁殖过程中,试管苗的无性繁殖后代DNA甲基化水平逐渐升高,仅部分变异的甲基化模式能够在试管苗的无性繁殖后代中稳定传递。两个品种之间,纽织培养对DNA甲基化变异程度的影响不同。     

A morphological study of flower initiation and development in strawberry (Fragaria x ananassa) using cryo-scanning electron microscopy

The morphological changes in the apex of strawberry (Fragaria x ananassa) cv. Elsanta during flower initiation and early development were studied by means of apical dissections and cryo-scanning electron microscopy. Characteristic stages of development were recorded from the earliest discernible evidence of floral initiation until anthesis. The results are discussed in relation to previous studies of floral development in strawberry.     

Induced expression of the Fragaria × ananassa Rapid alkalinization factor-33-like gene decreases anthracnose ontogenic resistance of unripe strawberry fruit stages

Rapid alkalinization factor (RALF) genes encode for ubiquitous small peptides that stimulate apoplastic alkalinization through interaction with malectin-like receptor kinase. RALF peptides may act as negative regulators of plant immune response, inhibiting the formation of the signal receptor complex for immune activation. Recently RALF homologues were identified in different fungal pathogen genomes contributing to host infection ability. Here, FaRALF-33-like gene expression was evaluated in strawberry fruits inoculated with Colletotrichum acutatum, Botrytis cinerea, or Penicillium expansum after 24 and 48 h post-infection. To investigate the role of FaRALF-33-like in strawberry susceptibility, transient transformation was used to overexpress it in white unripe fruits and silence it in red ripe fruits. Agroinfiltrated fruits were inoculated with C. acutatum and expression, and histological analysis of infection were performed. Silencing of FaRALF-33-like expression in C. acutatum-inoculated red fruits led to a delay in fruit colonization by the fungal pathogen, and infected tissues showed less penetrated infective hyphae than in wild-type fruits. In contrast, C. acutatum-inoculated white unripe fruits overexpressing the FaRALF-33-like gene decreased the ontogenic resistance of these fruits, leading to the appearance of disease symptoms and penetrated subcuticular hyphae, normally absent in white unripe fruits. The different response of transfected strawberry fruits to C. acutatum supports the hypothesis that the FaRALF-33-like gene plays an important role in the susceptibility of fruits to the fungal pathogen C. acutatum.     

草莓的组织培养与快速繁殖研究

通过对草莓的茎尖生长点进行组织培养,获得草莓脱毒苗,并以此为试材,对草莓的快速繁殖以及生根培养进行了研究。结果表明：芽的最适诱导分化培养基为MS BA0．5mg／L IAA0．05mg/L,诱导率可达70％;最适增殖培养基为MS BA0．2～1．0mg／L,增殖倍率可达3．2;试管苗在1／2MS附加IAA0．5me／L的培养基上,经过10～15d的培养,95％生根成苗。     

S-扁桃酸脱氢酶基因的克隆及表达

S-扁桃酸脱氢酶能够选择性催化S-扁桃酸生成苯甲酰甲酸。通过PCR扩增获得Pseudomonas p utida NUST的S-扁桃酸脱氢酶全长基因(mdlA),并构建了表达载体pET30a(+)-mdlA,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导获得表达,SDS-PAGE结果显示表达蛋白为43kDa。所以工程菌细胞具有转化S-扁桃酸生成苯甲酰甲酸能力。