甜瓜乙烯信号转导途径关键因子基因CTR1的克隆及表达特性分析

在拟南芥中,CTR1在乙烯信号转导途径中发挥重要的负调控作用.目前的研究表明,在拟南芥中只存在一个CTR1基因.利用RT-PCR技术从甜瓜果实中克隆得到CTR1基因cDNA(Cm-CTR1).Cm-CTR1cDNA全长2 613 bp,编码870个氨基酸.氨基酸序列比对和同源性分析表明,所克隆的甜瓜CTR1基因与拟南芥CTR1基因相似度为53.69％.Cm-CTR1的C-末端具有明显的类似于哺乳动物和果蝇中的Raf( retro-viral protein,V-raf)蛋白激酶家族的丝/苏氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase)的特征.该结构具有所有已知蛋白激酶所共有的11个亚结构域,其中包括ATP结合位点和丝/苏氨酸蛋白激酶位点结构域,说明CmCTR1与其他植物CTR1相似.实时荧光定量PCR分析结果表明,从授粉后第15天到第20天,甜瓜果实Cm-CTR1基因表达量显著增加,第20天的表达量是第15天的2.5倍,之后表达水平趋于稳定,第40天到第45天表达量有所下降.     

左侧视网膜剥夺鸽左前脑差异表达基因全长cDNA的克隆

利用cDNA末端快速扩增 (RACE)技术克隆了一条由左侧视网膜剥夺造成左前脑差异表达EST片段的全长cDNA序列 ,同源性比较后认定 ,其为鸽e(r)基因 .该基因与人类及斑马鱼等脊椎动物e(r)基因的同源性非常高 ,但C端有明显差异 .RNA斑点杂交、逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)及Northern印迹等方法检测 ,该基因在不同组织中表达量有差异 .结果表明 ,鸽e(r)基因在左眼视网膜剥夺鸽的左前脑及肝、肾中的表达量较高 ,该基因的表达具有一定的组织表达特异性 .     

桔小实蝇CYP4D46的克隆及其组织特异性表达研究

从桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)成虫体内提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术获得了一个新的细胞色素P450基因cDNA序列全长.该基因经细胞色素P450基因命名委员会命名为CYP4D46(Gen-Bank登录号:GU292422),其cDNA全长为1717 bp,包含1530 bp的完整开放阅读框(ORF),编码510个氨基酸,理论分子量约为58.40 kD,等电点为8.82.系统发育分析表明该基因与昆虫第4家族P450基因具有较高的同源性.实时定量PCR分析发现,CYP4D46基因在脂肪体中的相对表达量较高,分别是马氏管和中肠内的756倍和60倍,说明CYP4D46可能与脂肪体的重要生理功能相关.     

异育银鲫过氧化物还原酶基因的克隆及其表达分析

采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增技术从异育银鲫Carassius auratus gibelio肝脏中克隆了过氧化物还原酶(Prx)基因的cDNA全长序列。结果显示,异育银鲫过氧化物还原酶(CaPrx)基因cDNA全长1035 bp,开放阅读框长594 bp,编码197个氨基酸。在氨基酸序列的N端和C端各有一个保守的Cys残基,属于2-半胱氨酸类Prxs家族。多序列比对和系统进化树分析表明,异育银鲫与鲫Carassius auratus、青鱼Mylopharyngodon piceus、斑马鱼Danio rerio、犀角金线鲃Sinocyclocheilus rhinocerous和朝鲜鳑鲏Rhodeus uyekii等鱼类的Prx基因具有很高的同源性。实时荧光定量PCR结果显示,CaPrx基因在异育银鲫体内广泛表达,在血细胞和肝脏中表达量最高,在鳃和头肾的表达量较少。在感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的个体中,肝脏和脾脏的CaPrx基因表达量显著下降,表明其抗氧化作用因病毒的感染而受到了一定的破坏。     

长春花丙二烯氧化物合酶基因的克隆与表达

利用RT-PCR和RACE相结合的方法,从长春花中克隆了丙二烯氧化物合酶(AOS)基因。结果显示:长春花AOS基因(CrAOS)cDNA全长为2 118bp,包括5′和3′非翻译区,polyA尾和一个长1 638bp的开放阅读框,其基因组中不含内含子;CrAOS基因编码的蛋白含545个氨基酸。多重比对表明CrAOS蛋白与其他的AOS蛋白具有较高的相似性,CrAOS蛋白序列中含有AOS家族应有的保守氨基酸残基。Southern杂交表明:CrAOS基因在长春花中为低拷贝。qRT-PCR结果显示:CrAOS在各个组织均有表达但表达量存在差异,在老叶中最高,在幼花中表达最低。对长春花幼苗进行不同处理,结果表明:伤害、低温、甲基茉莉酸、乙烯利处理等可使CrAOS基因表达量显著提高,水杨酸处理对基因表达影响不大。     

油菜profilin基因的克隆和表达分析

profilin是高等植物中的一种与肌动蛋白结合的蛋白,采用RT-PCR技术克隆了油菜（Brassica napus L.cv.canadian tween)花粉中的一个369bp的cDNA片段,序列分析结果表明,该cDNA与已报道的其他植物的profilin基因具有较高核酸序列同源性,与玉米（Zea maysL.)基因同源性为82%,拟南芥（Arabidopsis)基因同源性为85%,水稻（Oryza sativa L.)基因同源性为81%,烟草（Nicotiana tabacum L.)基因同源性为82%,结论5′RACE和3′RACE技术,获得了全长cDNA,其为672bp。该cDNA包含一个开放密码框。5′未翻译区和一个带有Poly(A)的3′区域。Northern杂交结果显示它主要在花粉和花药中表达。     

毛白杨乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因(PtFATB)的克隆与表达分析

植物脂肪酸合成的主要部位是叶绿体,叶绿体向外运输脂肪酸的种类和数量受到乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶(FATB)控制。FATB基因在植物生长过程起着非常关键的作用。本研究以毛白杨为材料,将生物信息学知识和分子生物学手段相结合,首先利用现有的杨树基因组EST序列库资源,通过同源序列搜索,经过多次拼接合并获得了理论的杨树脂肪酸去饱和酶基因PtFATB序列全长,利用RT-PCR手段成功克隆得到了毛白杨FATB基因全长编码序列cDNA,该cDNA全长1,450bp,包括起始密码子ATG和144bp的5′末端非编码区,终止密码子TGA和40bp的3′末端非编码区,开放阅读框编码421个氨基酸。通过RT-PCR半定量研究了PtFATB在叶片组织中的表达量最高,茎、根中的表达量依次降低。在低温、干旱、NaCl、ABA四种条件下诱导生长24h,只有在低温的条件下发现PtFATB表达量略微降低,其他几种情况未有变化,该结果表明PtFATB呈组成型表达。上述结果为植物脂肪酸的基因工程提供了基础。     

盐地碱蓬(Suaeda salsa)APX 基因的克隆及盐胁迫下的表达

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)中克隆了抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbateperoxidase ,APX)的全长cDNA(SsAPX) ,基因注册号为AY0 34 893。SsAPX全长 1.1kb ,推导的氨基酸序列长为 2 5 0个氨基酸残基。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的菠菜(Spinaciaoleracea)细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因同源性最高 ,在核苷酸水平上一致性为 87% ,在氨基酸水平上一致性为 89%。Southern杂交表明APX基因在盐地碱蓬基因组中只有 1个拷贝。盐 (NaCl 40 0mmol/L)处理不同时间后的Northern杂交分析表明盐地碱蓬中SsAPX基因在盐胁迫下表达量增加 ,而且在盐胁迫下抗坏血酸过氧化物酶的活性也显著地增加 ,说明该基因受盐诱导。推测抗坏血酸过氧化物酶可能在保护盐地碱蓬免受氧化损伤的过程中起到一定作用     

鲢鱼解偶联蛋白2全长cDNA序列的克隆及其组织表达

从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)肝脏,通过简并引物克隆解偶联蛋白2(un-couplingprotein2,UCP2)cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏UCP2cDNA全序列。序列分析结果表明,鲢鱼肝脏UCP2cDNA全长1452bp,其中5′-UTR长337bp,3′-UTR长182bp,编码区933bp,编码310个氨基酸,推测的氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白3个特征结构及解偶联蛋白(UCPs)的特征序列。对鲢鱼不同组织UCP2的表达调控研究发现,鲢鱼组织UCP2基因在肠道、肝脏、肌肉、脂肪组织均大量表达,而在脑组织表达量较低,这与鲢鱼体内微囊藻毒素在这几个组织的分布完全一致,表明UCP2的功能可能与抑制微囊藻毒素引发过量活性氧(ROS)生成有关。     

草鱼AMBP基因cDNA的克隆与序列分析

α1-微球蛋白和Bikunin是由同一基因翻译表达出的两种功能不相关联的血浆蛋白。本文通过快速扩增cDNA末端的方法,首次从草鱼肝脏组织克隆了α1-微球蛋白和Bikunin前体蛋白(α1-microglobulin/Bulinin precursor, AMBP）基因全长cDNA。其cDNA全长1230bp,包含5′非翻译区23 bp,3′非翻译区160 bp和开放读码框1047 bp。开放读码框编码348个氨基酸,包含182个氨基酸的α1-微球蛋白和145个氨基酸的Bikunin。草鱼AMBP与其他物种的氨基酸序列分析结果表明,它们具有较高的同源性(44.7%－84.4%),其中草鱼与斑马鱼同源性最高(84.4%)。结果表明AMBP序列结构和α1-微球蛋白与Bikunin共翻译表达特点在动物机体中具有着重要的生理意义。     

冠突曲霉AN1类锌指蛋白zfpA基因的克隆及表达分析

本研究采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆出冠突曲霉中zfpA基因的cDNA全长序列并进行生物信息分析。该序列全长1 443 bp,开放阅读框长度为924 bp,从312~1 235 bp,没有内含子序列。推测编码的蛋白质含有307个氨基酸,同源性分析显示该基因与米曲霉的AN1锌指蛋白(XP_001826567)相似性达71%。利用荧光定量PCR技术分析了zfpA基因在营养菌丝体阶段、无性产孢阶段及有性产孢阶段的表达量差异。结果表明,这个基因在在无性产孢时期的表达量最低,有性产孢时期的表达量最高,相比无性产孢时期上调了4倍。本实验为深入研究zfpA基因对冠突曲霉的产孢调控机制奠定了基础。     

蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的克隆及表达分析

采用筛选cDNA文库的方法,首次克隆了蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的全长cDNA序列和DNA序列,序列分析表明,蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy不含内含子,开放阅读框（ORF）为1,074bp,编码357个氨基酸,推测蛋白的分子量为39.78kDa,等电点（pI）为5.53;利用在线软件分析表明,该蛋白既不是分泌型蛋白也不是膜蛋白;同源性比对结果表明,该蛋白与其他真菌中的氰化物水合酶蛋白的同源性较高,具有高度保守的催化三联体特征。用qRT-PCR方法分析了该基因在蝗绿僵菌侵染昆虫过程中的表达情况,结果表明,MaChy在蝗绿僵菌侵染穿透昆虫体壁阶段的表达量最高,约为体内阶段表达量的2.5倍,推测该基因可能在蝗绿僵菌穿透昆虫体壁的过程中起重要作用。     

绞股蓝法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及其序列分析

目的:克隆并分析绞股蓝法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因的全长序列。方法:参照罗汉果法呢基焦磷酸合酶基因,设计扩增绞股蓝FPS基因的3′RACE引物,采用3'RACE和5'RACE法克隆绞股蓝FPS基因全长cDNA。结果:获得绞股蓝FPS基因全长cDNA序列共1288个核苷酸,包含一个1026核苷酸的开放读框,编码342个氨基酸残基,推断该蛋白的相对分子质量为3.94×104。NCBI Blast结果显示绞股蓝FPS基因编码蛋白的氨基酸序列与已知的植物FPS氨基酸序列的同源性为91%~74%,核酸序列的同源性为88%~78%。结论:克隆了绞股蓝FPS基因全长cDNA序列,为进一步研究绞股蓝FPS基因的表达及三萜皂苷合成通路关键酶分子的进化奠定了基础。     

球毛壳菌（Chaetomium globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础,用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17.5kD,理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符,说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。     

盐地碱蓬GST基因的克隆、序列分析及其表达特征

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)幼苗的cDNA文库中克隆到一个 0 .9kb的全长cDNA ,同源性分析表明该全长cDNA与已报告的大豆 (Glycinemax)GST基因相应序列的同源性达 5 5 % ,可能编码由 2 35个氨基酸组成的谷胱甘肽转移酶 (glutathioneS transferase ,GST)。Southern杂交结果证明GST基因在碱蓬基因组中可能有至少两个以上的拷贝 ;Northern杂交结果表明 ,4 0 0mmol/L的NaCl处理 4 8h ,幼叶中GSTmRNA的表达量是对照的 2～ 3倍 ,说明碱蓬中GST基因受盐诱导     

马氏珠母贝galectin-4基因cDNA的克隆及表达分析

半乳糖凝集素(Galectins)属于一种多功能凝集素家族,在机体抵抗微生物的感染中起重要作用。本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得马氏珠母贝galectin-4(PmGal-4)基因cDNA的全长,并对其序列进行分析。PmGal-4基因cDNA全长1 071 bp,5′非翻译区(5′UTR)长75 bp,3′非翻译区(3′UTR)长72 bp;其开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为924 bp,编码307个氨基酸组成的前体肽,理论分子量约为34.6 kD,理论等电点为8.80。多序列比对结果显示各物种间galectin-4具有高保守性。序列分析结果显示PmGal-4的氨基酸序列具有典型富含半胱氨酸(cysteine-rich domain,CRD)的结构域。实时荧光定量PCR分析表明,PmGal-4基因在马氏珠母贝所检测的组织中呈组成型表达特征,但在闭壳肌和外套膜中表达量最高。上述结果表明PmGal-4基因可能参与了马氏珠母贝多种生理功能,特别是在免疫防御反应中具有重要的作用。     

鲢鱼解偶联蛋白2全长cDNA序列的克隆及其组织表达

从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)肝脏，通过简并引物克隆解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2) cDNA核心序列，应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列，最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏UCP2 cDNA全序列。序列分析结果表明，鲢鱼肝脏UCP2 cDNA全长1 452 bp，其中5′-UTR长337 bp，3′-UTR长182 bp，编码区933 bp，编码310个氨基酸，推测的氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白3个特征结构及解偶联蛋白(UCPs)的特征序列。对鲢鱼不同组织UCP2的表达调控研究发现，鲢鱼组织UCP2基因在肠道、肝脏、肌肉、脂肪组织均大量表达，而在脑组织表达量较低，这与鲢鱼体内微囊藻毒素在这几个组织的分布完全一致，表明UCP2的功能可能与抑制微囊藻毒素引发过量活性氧(ROS)生成有关。     

香蕉胁迫相关蛋白基因的克隆及其表达分析

通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得胁迫相关蛋白基因,命名为MaSAP1(GenBank登录号为AGH14257.1)。扩增获得的cDNA序列与质粒OZ092的目的片段序列一致,表明MaSAP1是香蕉SAP基因编码框全长cDNA,包含一个510bp的最大开放阅读框,编码一个长169个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的A20和AN1基序结构。系统进化树比对分析表明,MaSAP1与水稻和獐茅的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaSAP1基因在香蕉根和果实中的表达量较高,在茎中的表达量最低。实时荧光定量PCR分析表明MaSAP1响应激素的处理,同时也响应干旱、低温、高盐和枯萎病菌的侵染等胁迫。可见,MaSAP1基因在植物生长发育和植物响应逆境中具有重要作用。     

湖北海棠MhPR1a基因的克隆与表达特性分析

以水杨酸诱导的湖北海棠[ Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.]全长cDNA文库和基因组DNA为模板,克隆其PR1a基因(MhPR1a)的全编码区序列,并对该序列进行生物信息学分析;在此基础上利用荧光定量RT-PCR技术对湖北海棠根、茎和叶中该基因的表达特性及经过10μmol·L-1ABA、4℃低温处理及苹果蚜虫(Aphis citricola van der Goot)侵染后叶中该基因的表达特性进行了测定.结果表明:克隆获得的MhPR1a基因全长518 bp,最大开放阅读框为492 bp,编码162个氨基酸残基;编码的蛋白质为酸性蛋白,其相对分子质量为16 960,等电点pI 5.46;其基因组DNA序列与cDNA序列完全一致,说明MhPR1a基因内部没有内含子.湖北海棠MhPR1a基因与苹果(M.domestic Borkh.)和沙梨[Pyrus pyrifolia( Burm.f.)Nakai] PR1基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列同源性均较高,其中cDNA序列的同源性均为97％,氨基酸序列的同源性分别为95％和97％;系统树也显示MhPR1a基因编码的氨基酸序列与苹果和沙梨的亲缘关系最近,聚为一类.MhPR1a基因编码的氨基酸序列具有SCP保守结构域,含有1个信号肽和6个保守的半胱氨酸残基.在湖北海棠的叶、茎和根中MhPR1a基因均能表达,在根中的表达量最高.10 μmol·L-1ABA和4℃低温处理48 h后均可诱导MhPR1a基因的表达,且相对表达量明显高于对照(处理0h);苹果蚜虫也可诱导MhPR1a基因的表达,说明MhPR1a基因在湖北海棠抵抗植食昆虫和低温胁迫的过程中可能发挥着重要作用.     

红罗非鱼Na~+-K~+-ATPase α基因的克隆及其在不同盐度条件下mRNA表达差异

为获知红罗非鱼(Oreochromis sp.)Na+-K+-ATPaseα基因的全长分子结构及其在不同盐度条件下的表达情况,采用同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)方法,首次在红罗非鱼鳃组织中克隆到了全长为3 379 bp的Na+-K+-ATPaseα基因全长cDNA序列,该序列包含3 072 bp的开放阅读框(ORF),143 bp的5'末端非编码区(UTR)和164 bp的3'末端非编码区(UTR),编码1023个氨基酸,预测分子量为112.5 kD,理论等电点为5.26。BLAST分析显示红罗非鱼Na+-K+-ATPaseα基因编码的氨基酸序列与其它已知物种相应基因编码的氨基酸序列的同源性达到97%-99%;系统进化分析显示,红罗非鱼Na+-K+-ATPaseα亚基与萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)和莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)亲缘关系较近。应用Real-time PCR技术,以β-actin基因为内参,对不同盐度(0、15、25、32 g/L)条件下鳃组织中Na+-K+-ATPaseα基因的表达情况进行了比较分析,结果表明,当盐度为25 g/L时,Na+-K+-ATPaseα基因的表达量达到峰值,而盐度升至32 g/L时,其表达量呈下降趋势;各盐度处理组中,养殖12 h后Na+-K+-ATPaseα基因的mRNA表达量显著上升(P0.05)并达到最高;随着养殖时间的延长,24 h后该基因mRNA表达量开始降低,但仍然显著高于对照组的表达量值(P0.05)。