γ-谷氨酰羧化酶基因过表达对兔骨关节炎软骨细胞分化的影响

通过将GGCX慢病毒转染软骨细胞,探讨骨关节炎患者软骨组织中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因过度表达对兔骨关节炎(OA)软骨细胞分化的影响及其机制。本研究首先从OA兔体内分离软骨细胞,用茜素红染色标记软骨细胞。然后将分离的软骨细胞分为正常对照组、GGCX过表达组和载体组3组。编码GGCX的慢病毒用于过表达GGCX,流式细胞分析检测出病毒转染后细胞凋亡。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法用于检测GGCX、基质金属蛋白酶13 (MMP13)、Ⅹ型胶原、Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1β。慢病毒编码GGCX提高了OA软骨细胞中中GGCS的表达水平,mRNA和蛋白水平都显著升高(p0.05)。正常对照组的凋亡率为26.12%,载体组的凋亡率为26.12%左右,GGCX过表达组的凋亡率为18.17%,GGCX过表达可明显减少软骨细胞细胞凋亡(p0.05)。GGCX过表达显著增加Ⅱ型胶原,而mRNA和蛋白水平均降低MMP13、Ⅹ型胶原、TNF和IL-1β表达(p0.05)。相对于载体,GGCX过表达抑制了OA软骨细胞的细胞凋亡。GGCX过表达可调节细胞外基质的平衡,促进软骨细胞蛋白多糖合成,这与细胞凋亡减少有关。     

锌转运蛋白ZIP8 在骨关节炎中的表达及其机制研究

目的:探讨锌转运蛋白ZIP8在骨关节炎患者中的表达及其对软骨细胞生长及基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响。方法:收集20例骨关节炎患者(OA组)和20例非骨关节炎患者(对照组)血清和软骨组织;采用原子吸收分光光度计测定患者血清和软骨组织中锌离子的表达水平;MTT方法检测软骨细胞的生长活力;采用小RNA干扰沉默ZIP8基因的表达;实时荧光定量PCR方法检测ZIP8及金属基质蛋白酶MMP3、MMP9、MMP12和MMP13等基因的m RNA表达水平;蛋白免疫印迹检测ZIP8及MMP3、MMP9、MMP12和MMP13等蛋白的表达水平。结果:OA组的血清和软骨组织中的锌离子浓度明显高于对照组(P0.01)。OA组软骨组织中ZIP8的m RNA(P0.05)和蛋白(P0.01)表达水平显著高于对照组。ZIP8小RNA干扰片段可以有效的沉默ZIP的基因表达(P0.01);沉默ZIP8的表达促进骨关节炎患者来源的软骨细胞的生长(P0.05),并且降低基质金属蛋白酶包括MMP3,MMP9,MMP12和MMP13的表达水平(P0.05)。结论:ZIP8与骨关节炎密切相关,沉默ZIP8的表达可以提高软骨细胞的生长活力,并且抑制基质金属蛋白酶的表达,为骨关节炎的治疗提供了新的靶点。     

LncRNA MEG3通过抑制Wnt/β-catenin信号通路对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)人母系表达基因(Maternally expressed gene 3,MEG3)对骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法:选取我院住院的OA患者和半月板损伤患者各40例,采用RT-PCR检测两组患者软骨组织和细胞中MEG3的表达。在OA软骨细胞中,转染si RNA-MEG3(si-MEG3)或过表达MEG3的慢病毒载体(LV-MEG3),采用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况,RT-PCR和western blot检测PCNA、Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达。结果:OA患者膝关节软骨组织中MEG3的表达水平明显低于半月板损伤患者软骨组织(P0.05),同时OA软骨细胞中MEG3的表达水平明显低于正常软骨细胞(P0.05)。OA软骨细胞转染siMEG3后,细胞增殖能力和PCNA表达明显下降(P均0.05),G0/G1期细胞比例明显升高(P0.05),S期细胞比例明显下降(P0.05),细胞凋亡率明显增加(P均0.05)。低表达MEG3能够显著降低Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达水平(P均0.05),增加GSK-3βm RNA和蛋白表达水平(P均0.05)。在OA软骨细胞转染LV-MEG3后,细胞增殖能力和PCNA表达明显升高(P均0.05),G0/G1期细胞比例明显下降(P0.05),S期细胞比例明显增加(P0.05),细胞凋亡率明显减少(P均0.05)。高表达MEG3能够显著增加OA软骨细胞中Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达水平(P均0.05),降低GSK-3βm RNA和蛋白表达(P均0.05)。同时,采用XAV939阻滞Wnt/β-catenin信号通路能够显著逆转过表达MEG3对OA软骨细胞增殖和凋亡的影响。结论:MEG3在OA患者和软骨细胞中均显著低表达,并能够通过阻滞Wnt/β-catenin信号通路激活影响OA软骨细胞增殖和凋亡。MEG3可能成为OA治疗的重要靶分子。     

p53调控骨关节炎软骨细胞凋亡

肿瘤抑制蛋白p53是一种可以有效调节哺乳动物细胞生长的核磷酸化蛋白质。p53表达增加能够激活一系列细胞基因,通过抑制多个细胞周期蛋白依赖性激酶导致细胞周期停滞并凋亡。有研究表明,骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞中,p53的表达高于正常软骨细胞,通过下调p53表达能够减少软骨细胞凋亡,进而预防和缓解骨关节炎病变,这可能与线粒体凋亡途径密切相关,但是具体机制尚不明确。本文通过综述近年来p53调控骨关节炎软骨细胞凋亡的文献资料,为骨关节炎机制和治疗有关研究提供理论基础。     

circPPP1R12A激活p53信号通路调控骨关节炎中软骨细胞增殖和凋亡

摘要 目的：探讨circPPP1R12A（circ_0000423）调控p53信号通路对骨关节炎（osteoarthritis,OA）中软骨细胞增殖和凋亡的影响。方法：采用qRT-PCR检测circPPP1R12A在OA软骨细胞中的表达水平。在OA软骨细胞中分别转染oe-circPPP1R12A和sh-circPPP1R12A后,采用CCK-8检测细胞增殖情况;免疫荧光检测Ki-67阳性细胞表达率;流式细胞术检测细胞凋亡情况;qRT-PCR检测Ki-67和p53表达水平;Western Blot检测Cleaved-caspase3、P53、BCL-2和BAX的表达水平。结果：OA软骨细胞中circPPP1R12A的表达水平明显高于正常软骨细胞。过表达circPPP1R12A能够抑制OA软骨细胞增殖和促进细胞凋亡,通过上调p53表达激活p53信号通路,低表达circPPP1R12A能够促进OA软骨细胞增殖和抑制细胞凋亡,通过下调p53表达阻滞p53信号通路。在OA软骨细胞中同时低表达circPPP1R12A和过表达p53能够反转单独低表达circPPP1R12A对OA软骨细胞增殖和凋亡的影响。结论：circPPP1R12A在OA软骨细胞中明显高表达,circPPP1R12A能够通过激活p53信号通路抑制骨OA软骨细胞增殖和促进软骨细胞凋亡。circPPP1R12A可能成为OA治疗的干预靶点。     

不同程度骨关节炎中Wnt/β-catenin信号通路、OPN和MMP-13的相关性的研究

目的:研究不同严重程度骨关节炎模型兔的软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)和基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13,MMP-13)的相关性。方法:将40只新西兰大耳白兔随机分成4组,通过注射不同浓度木瓜蛋白酶处理,而构建患有不同程度骨关节炎的兔模型。利用Real-Time PCR法和ELISA法分别检测β-catenin、OPN、MMP-13以及Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的m RNA和蛋白的水平。结果:利用不同浓度的木瓜蛋白酶成功建立OA兔模型,通过Mankin评分可分成轻度、中度和重度三级。在不同分级的OA模型兔中,β-catenin、OPN、MMP-13的浓度均高于正常对照组,而Ⅱ型胶原和蛋白聚糖较正常对照组均下降(P0.05);且随着OA严重程度增加,结果具有一致性(P0.05)。结论:Wnt/β-catenin信号通路可调节OPN的表达,进而影响到MMP-13的表达,最终对骨关节炎的发生产生影响。     

MiR-127-5p通过靶向调节adipoR1促进骨关节炎软骨细胞的增殖

脂联素（adiponection）与骨关节炎（osteoarthritis, OA）的发病密切相关,且主要通过其受体adipoR1发挥作用。而骨关节炎中脂联素的表达是否受miRNA表达的影响却未见报道。本文旨在研究miR-127-5p对骨关节炎软骨细胞中脂联素及细胞增殖的影响。分离培养人原代OA软骨细胞及对应正常细胞,甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定。 Real-time PCR结果表明,OA软骨细胞中miR-127-5p的表达与正常软骨细胞中的相比较显著下降。MiR-127-5p转染可显著降低荧光素酶报告基因的荧光强度（P<0.05）,表明adipoR1为miR-127-5p的靶向基因。MiR-127-5p mimic转染软骨细胞后,MTT法研究结果表明,miR-127-5p mimic 可显著促进软骨细胞增殖,Western 印迹结果表明,脂联素及其受体（adipoR1）表达显著上升,p65的表达以及p38、ERK1/2以及IkBα的磷酸化水平显著下降。ELISA结果表明,MMP-1、MMP-3、MMP-13的含量显著下降。实验结果提示,miR-127-5p通过靶向下调adipoR1及脂联素的表达,促进软骨细胞增殖,并且抑制NF-κB信号通路,进而抑制炎性反应。     

miR-130a-3p调控SOX4对骨关节炎软骨细胞增殖、分化和炎症因子释放的影响

目的:探讨miR-130a-3p对骨关节炎(osteoarthritis, OA)软骨细胞增殖、分化和炎症因子释放的影响及作用机制。方法:收集我院住院的40例半月板损伤患者和40例OA患者,采用RT-PCR检测半月板损伤患者和OA患者膝关节软骨组织中miR-130a-3p的表达。在OA软骨细胞中分别转染miR-NC、miR-130a-3p mimics、miR-130a-3p inhibitors、si RNA-SOX4(si-SOX4)或过表达SOX4的慢病毒载体(LV-SOX4),采用CCK8法检测细胞增殖情况;RT-PCR和western blot检测细胞分化相关分子BMP2和BMP4;RT-PCR检测炎症因子IFN-γ和TNF-α的表达。结果:半月板损伤患者软骨组织和软骨细胞中miR-130a-3p的表达明显高于OA患者(P均0.05),而SOX4的表达水平明显低于OA患者(P0.05)。OA患者膝关节软骨组织中miR-130a-3p和SOX4的表达呈显著负相关(P0.05)。miR-130a-3p mimics能够明显促进OA软骨细胞增殖(P0.05)、增加分化相关分子BMP2和BMP4的表达(P均0.05)以及抑制炎症因子IFN-γ和TNF-α的表达(P均0.05)。miR-130a-3p inhibitors能够明显抑制OA软骨细胞增殖(P0.05)、分化相关分子BMP2和BMP4的表达(P均0.05)以及促进炎症因子IFN-γ和TNF-α的表达(P均0.05)。OA软骨细胞在转染miR-130a-3p mimics后,SOX4 mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P均0.05),在转染miR-130a-3p inhibitors后,SOX4 mRNA和蛋白的表达水平明显升高(P均0.05)。双荧光素酶结果显示miR-130a-3p能够靶向结合SOX4。在OA软骨细胞中,采用si RNA低表达SOX4后,明显促进细胞增殖和分化以及抑制炎症因子的释放。共转染miR-130a-3p mimics和LV-SOX4能够逆转过表达miR-130a-3p对OA软骨细胞增殖、分化和炎症因子释放的影响(P均0.05),而共转染miR-130a-3p inhibitors和LV-SOX4能够进一步加强低表达miR-130a-3p对OA软骨细胞增殖、分化和炎症因子的影响(P均0.05)。结论:miR-130a-3p在OA中明显低表达,并能够通过靶向抑制SOX4促进OA软骨细胞增殖、分化和炎症因子释放。     

Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的影响

目的:研究Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的作用探讨骨关节炎(OA)发生及进展的可能途径和分子机制。方法:β-catenin过表达慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,荧光显微镜观察病毒转染情况.Western blot方法:检测滑膜细胞核内β-catenin蛋白表达。Transwell小室共培养人滑膜细胞与正常人软骨细胞,倒置显微镜观察滑膜细胞对软骨细胞生长形态变化的影响。酶联免疫吸附(ELISA)法检测不同时间点共培养体系中软骨细胞培养上清液中MMP-7的变化找出MMP-7变化最明显的时间点。同时在最佳时间点ELISA方法:检测软骨细胞培养上清液CTX-Ⅱ、COMP的水平。结果:慢病毒转染滑膜细胞后茨光显微镜下可见多数滑膜细胞表达荧光.Western blot检测发现滑膜细胞胞浆及胞核中β-catenin表达明显上调(P0.01)。通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后,光镜下观察软骨细胞生长形态变化不明显,但随共培养时间的延长软骨细胞生长受到抑制胞体边缘发白壁强度降低。ELISA结果:显示通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后软骨细胞上清液中MMP-7表达明显升高,与正常组相比有显著差异(P0.01)软骨细胞上清液MMP-7的变化有一定的时间依赖性在共培养2h、6h、12h时逐渐升高;24h时略有降低且在共培养6h时变化最为明显。而共培养6h时通路激活组软骨细胞培养上清液中COMP、CTX-Ⅱ水平与正常对照组相比均明显升高(P0.01)。结论:β-catenin过表达慢病毒转染正常人滑膜细胞可成功激活Wnt/β-catenin信号通路,Wnt/β-catenin信号通路活化的滑膜细胞可影响正常软骨细胞的生长,并引起滑膜-软骨体系内环境异常,促使软骨基质的降解这可能是滑膜炎促进OA发生、发展的机制之一。     

MMP3慢病毒表达载体构建及其修饰的胚胎干细胞的作用

[目的]构建基质金属蛋白酶3(Matrix metalloproteinase3,MMP3)基因过表达慢病毒载体,修饰胚胎干细胞(ES)检测其对成纤维细胞的作用。[方法]克隆MMP3基因,构建EGFP标记的MMP3慢病毒表达载体,用GP2-293T细胞包装慢病毒,修饰ES细胞,与成纤维细胞3T3共培养。镜下观察绿色荧光蛋白表达,Western Blot检测MMP3和TGF-β蛋白表达。[结果]成功钓取MMP3基因,并构建慢病毒表达载体LV-MMP3-EGFP;在转染的GP2-293T细胞中表达绿色荧光蛋白;修饰后的ES细胞表达绿色荧光蛋白,72 h蛋白表达量最高,转染效率达到80%以上;被修饰细胞中MMP3蛋白表达高于对照组,其表达量是对照组的1.5倍;共培养后3T3细胞中TGF-β蛋白表达实验组与对照组无显著变化。[结论]LV-MMP3-EGFP修饰的ES细胞能够大量表达MMP3蛋白,作用于细胞外基质,但是对成纤维细胞中TGF-β表达没有显著影响(P0.05)。     

Wnt/beta-catenin 信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的影响

目的：研究Wnt/beta-catenin 信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的作用,探讨骨关节炎（OA）发生及进展的可能途径和分子 机制。方法：beta-catenin 过表达慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,荧光显微镜观察病毒转染情况,Western blot方法检测滑膜细胞核 内beta-catenin 蛋白表达。Transwell 小室共培养人滑膜细胞与正常人软骨细胞,倒置显微镜观察滑膜细胞对软骨细胞生长形态变化 的影响。酶联免疫吸附（ELISA）法检测不同时间点共培养体系中软骨细胞培养上清液中MMP-7 的变化,找出MMP-7 变化最明 显的时间点。同时在最佳时间点ELISA 方法检测软骨细胞培养上清液CTX-II、COMP的水平。结果：慢病毒转染滑膜细胞后,荧 光显微镜下可见多数滑膜细胞表达荧光,Western blot检测发现滑膜细胞胞浆及胞核中茁-catenin 表达明显上调（P<0.01）。通路活 化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后,光镜下观察软骨细胞生长形态变化不明显,但随共培养时间的延长软骨细胞生长受到抑 制,胞体边缘发白,贴壁强度降低。ELISA 结果显示通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后软骨细胞上清液中MMP-7表达 明显升高,与正常组相比有显著差异（P<0.01）,软骨细胞上清液MMP-7 的变化有一定的时间依赖性,在共培养2 h、6 h、12 h时逐 渐升高,24 h 时略有降低,且在共培养6 h 时变化最为明显。而共培养6 h时通路激活组软骨细胞培养上清液中COMP、CTX-II水 平与正常对照组相比均明显升高（P<0.01）。结论：茁-catenin 过表达慢病毒转染正常人滑膜细胞可成功激活Wnt/茁-catenin 信号通 路,Wnt/茁-catenin 信号通路活化的滑膜细胞可影响正常软骨细胞的生长,并引起滑膜- 软骨体系内环境异常,促使软骨基质的降 解,这可能是滑膜炎促进OA 发生、发展的机制之一。     

液泡分选蛋白4B对骨关节炎软骨细胞凋亡的调控作用

目的:探讨液泡分选蛋白4B(VPS4B)对骨关节炎软骨细胞凋亡的调控作用。方法:通过内侧半月板部分切除加前交叉韧带切断的方法建立骨关节炎SD大鼠模型,通过RT-PCR和免疫组化检测VPS4B在大鼠关节软骨中的表达。番红O/固绿染色方法检测大鼠膝关节软骨组织形态变化。通过用10 ng/mL的IL-1β诱导人软骨肉瘤细胞SW1353 24 h来模拟骨关节炎样软骨细胞损伤,Western blot检测SW1353细胞中VPS4B、凋亡相关因子(cleaved caspase-3和cleaved PARP)和磷酸化p38的表达。转染si-RNA敲低SW1353细胞中VPS4B表达,并评估其对IL-1β诱导的SW1353细胞凋亡标记和p38 MAPK信号通路的影响。膜联蛋白V (Annexin V)和碘化丙啶(PI)染色用于检测软骨细胞凋亡。结果:VPS4B在模型组大鼠的关节软骨中明显上调(P0.05)。IL-1β诱导24 h后,SW1353细胞中的VPS4B、cleaved caspase-3、cleaved PARP和p-p38蛋白表达水平均明显增加。而转染VPS4B-si RNA敲低VPS4B的表达后,cleaved caspase-3、cleaved PARP和p-p38蛋白表达水平均被抑制,并且抑制了IL-1β诱导细胞的凋亡率。结论:VPS4B在骨关节炎发病过程中明显上调,VPS4B的上调通过激活p38 MAPK信号通路来促进软骨细胞凋亡。     

慢病毒转染SPOP基因对滋养层细胞HTR8-SVneo增殖和侵袭的影响及其机制

为了探讨慢病毒转染SPOP基因后对滋养层细胞HTR8-SVneo增殖和侵袭能力的影响,并阐明其可能的机制,分别构建过表达和敲低SPOP基因的慢病毒载体,转入到HTR8-SVneo细胞中。分别在荧光显微镜下观察转染的荧光效率。用qRT-PCR法检测感染病毒后的细胞中SPOP mRNA的表达量,Western blotting法检测各组细胞中SPOP、PTEN、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β和GAPDH的表达量。采用CCK-8法检测各组细胞的增殖活力,Transwell小室法检测各组细胞的侵袭能力。结果显示,在HTR8-SVneo、JAR和JEG3这3种滋养层细胞中,HTR8-SVneo细胞中SPOP蛋白表达相对最高。HTR8-SVneo细胞经慢病毒转染后,与对照组比较,过表达组中SPOP mRNA和蛋白表达量明显升高(p0.01),PTEN蛋白表达量升高,而p-AKT和p-GSK3β表达量降低,细胞的侵袭能力明显下降(p0.05),细胞增殖活力无明显变化。相反,敲低组中SPOP mRNA和蛋白表达量明显下降(p0.01),PTEN蛋白表达量降低,p-AKT和p-GSK3β表达量升高,细胞的侵袭能力和增殖活力均明显增强(p0.05)。研究结果表明,慢病毒转染SPOP基因可以影响滋养层细胞HTR-8/SVneo的增殖和迁移能力,其机制可能与PTEN/AKT/GSK3β信号通路调节有关。     

27nt-miRNA对间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化的影响

为探讨27nt-miRNA对间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化影响,构建27nt-miRNA过表达、反义序列Anti-27nt-miRNA以及阴性对照的表达质粒,慢病毒包装后分别转染人脐带间充质干细胞(hUCMSC),加入Ⅳ型胶原诱导hUCMSC定向分化为血管平滑肌细胞。四唑盐(MTT)比色法检测分化后细胞活力,免疫细胞化学染色法检测分化后细胞SM22α(兔抗平滑肌22α,smooth muscle 22α)的表达,Western印迹法和RT-PCR检测分化后细胞内的SMA (兔抗平滑肌肌动蛋白,smooth muscle actin) mRNA、SM 22α mRNA及其蛋白质表达情况。经检测,27nt-miRNA过表达分化组与阴性对照组相比,细胞活力下降20.48%(P0.05),SMA mRNA、SM22α mRNA及其蛋白质表达量明显升高(P0.05);而Anti-27nt-miRNA分化组细胞活力上升了18.07%(P0.05),SMA mRNA、SM22α mRNA及其蛋白质表达量下降(P0.05)。综上所述,27nt-miRNA能够促进间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化,并且抑制分化后的细胞活力。     

高密度微团培养法对人骨关节炎软骨细胞分化影响的实验研究

目的探讨高密度微团(Micromass)的细胞培养方法对人骨关节炎软骨细胞终末期成熟分化的作用影响。方法临床获取人骨关节炎关节软骨组织,分离骨关节炎软骨细胞,分别进行低密度单层培养和高密度微团培养,隔日细胞换液1次。每2日倒置显微镜观察细胞形态的变化;碱性磷酸酶(ALP)染色方法检测ALP的分泌;RT-PCT方法检测细胞内Col2、Aggrecan、ALP和MMP-13等因子mRNA的表达。结果人骨关节炎软骨细胞具有自发性向终末期成熟分化的特征,在相同时间点,Micromass培养的软骨细胞与低密度单层培养的细胞相比,更具有软骨细胞的形态特征;ALP染色显示,Micromass培养的细胞内ALP染色强度明显减弱;RT-PCT显示,Micromass培养的细胞内Col2和Aggrecan因子mRNA的表达显著提高(P0.05);ALP和MMP-13因子mRNA的表达显著降低(P0.05)。结论高密度微团培养法抑制人骨关节炎软骨细胞过快的成熟分化,更好的维持了细胞的软骨细胞表型。     

缺氧微环境SIRT1亚细胞定位对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探究缺氧微环境SIRT1亚细胞定位对结直肠癌细胞凋亡的影响及其分子机制。方法:将编码过表达野生型SIRT1以及核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)突变型SIRT1(SIRT1NLSmt)的慢病毒载体转染人类结肠癌HCT116细胞株,经嘌呤霉素筛选获得稳定过表达野生型SIRT1细胞株(LV-SIRT1细胞)和细胞质定位的NLS突变型SIRT1细胞株(LV-SIRT1NLSmt细胞),通过观察慢病毒载体编码的SIRT1-GFP融合蛋白的荧光定位,明确稳定转染细胞中外源性SIRT1的亚细胞定位。利用real-time PCR、Western blot法对分离提取的核-质蛋白进行检测,证实外源性SIRT1的表达和亚细胞定位情况。利用CCK-8细胞毒性实验、流式细胞术检测和TUNEL染色比较缺氧(1%O2)处理前后LV-SIRT1和LV-SIRT1NLSmt细胞存活或凋亡情况,Western blot法检测凋亡相关蛋白p53、ac-p53(K382)、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved caspase-3表达水平。结果:Western blot、real-time PCR和免疫荧光染色结果显示稳定转染细胞均存在外源性SIRT1的过表达,NLS突变可导致SIRT1NLSmt富集于细胞质中;与亲本细胞HCT116和LV-SIRT1NLSmt细胞相比,LV-SIRT1细胞对缺氧的耐受能力最差、细胞凋亡水平最高,凋亡相关蛋白p53、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3表达水平显著升高,ac-p53(K382)和Bcl-2表达水平显著下降,且LV-SIRT1细胞的胞核ac-p53下降最为显著。结论:在缺氧微环境中,细胞核定位的SIRT1通过影响p53的去乙酰化水平促进结直肠癌细胞凋亡。     

干扰YAP1对食管癌Eca-109细胞生物学功能的影响

该文研究Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)对Eca-109细胞生物学功能的影响。构建针对YAP1基因的sh RNA慢病毒载体,转染Eca-109细胞,采用q PCR和蛋白印迹法检测转染前后Eca-109细胞中YAP1 m RNA和蛋白以及P53蛋白的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期、凋亡情况;CCK-8实验检测细胞的增殖情况变化。结果显示,慢病毒转染组细胞内YAP1 m RNA和蛋白表达量低于空白对照组和空病毒转染组,p53基因表达量高于空白对照组和空病毒转染组;Eca-109细胞增值率从第3 d开始低于对照组(P0.05);慢病毒转染组细胞G1期比例增高(P0.05),早期凋亡率增加(P0.05),以上差异均有统计学意义。结果表明,干扰YAP1可诱导Eca-109细胞凋亡,降低Eca-109细胞的增殖能力,且其抗凋亡的作用可能部分与p53基因相关。     

MLL3基因对宫颈癌细胞放射敏感性和DNA损伤修复能力的影响

摘要 目的：探究髓系/淋巴系或混合谱系白血病3基因（myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 3,MLL3）对宫颈癌细胞生长、转移、放射敏感性的影响。方法：选择60例宫颈鳞癌患者的癌组织及配对癌旁组织,采用实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测检测MLL3 mRNA水平。体外培养SiHa细胞,将其分为以下5组：Control组（不转染）、NC-sh组（转染阴性对照shRNA慢病毒）、MLL3-sh组（转染MLL3 shRNA慢病毒）、NC-OE组（转染阴性对照过表达慢病毒）和MLL3-OE组（转染MLL3过表达慢病毒）。进一步采用2300EX直线加速器9 MeV ?茁射线照射细胞建立放射抵抗SiHa细胞（SiHaR）,然后将其分为：NC-sh组、MLL3-sh组、8 Gy+NC-sh组和8 Gy+MLL3-sh组。NC-sh组和MLL3-sh组细胞不照射,8 Gy+NC-sh组和8 Gy+MLL3-sh组细胞用9 MeV β射线照射8 Gy。采用MTT法检测细胞增殖情况;Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡;Transwell检测细胞侵袭能力;qRT-PCR检测MLL3、共济失调毛细血管扩张征突变基因（ATM）、ATM-Rad3相关基因（ATR）、乳腺癌易感基因（BRCA1）和RAD50双链断裂修复蛋白（RAD50）的mRNA水平;Western blot检测MLL3、Bcl-2相关X蛋白基因（Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）、cleaved caspase 3、基质金属蛋白酶（MMP）2、MMP9和γ-H2AX的表达;免疫荧光染色检测γ-H2AX的表达。结果：与癌旁组织相比,宫颈鳞癌组织中的MLL3 mRNA水平显著降低（P<0.001）。与NC-sh组比较,MLL3-sh组SiHa细胞的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量降低,细胞活力升高,细胞凋亡率、Bax和cleaved caspase 3蛋白相对表达量降低,Bcl-2蛋白相对表达量升高,侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白相对表达量升高（P<0.05）。与NC-OE组比较,MLL3-OE组SiHa细胞的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量升高,细胞活力降低,细胞凋亡率、Bax和cleaved caspase 3蛋白相对表达量升高,Bcl-2蛋白相对表达量降低,侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白相对表达量降低（P<0.05）。与SiHa细胞相比,SiHaR细胞中的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量均升高（P<0.001）。与8 Gy+NC-sh组比较,8 Gy+MLL3-sh组SiHaR细胞的细胞活力降低,γ-H2AX的蛋白相对表达量和γ-H2AX foci数目升高,ATM、ATR、BRCA1和RAD50的mRNA水平降低（P<0.05）。结论：宫颈癌细胞MLL3的表达下调促进了其生长和转移,但降低DNA损伤修复能力,提高宫颈癌细胞的放射敏感性。     

应用原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系建立体外骨关节炎模型的效果评价

目的通过比较白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)处理对原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力、炎症因子与炎症通路表达水平变化的影响,为骨关节炎体外研究用细胞提供多重选择。方法免疫细胞化学法与甲苯胺蓝染色分别检测细胞中Ⅱ型胶原与蛋白多糖,鉴定所培养的原代细胞是否为软骨细胞。CCK-8法检测IL-1β(10ng/ml)处理24h、48h、72h对原代软骨细胞增殖活力的影响,IL-1β(1、10、20、40ng/ml)处理24h对SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力的影响。IL-1β(10ng/ml)分别处理原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系细胞24h后,ELISA法检测细胞培养上清中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)与基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)的表达水平。Real-time PCR法检测核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)mRNA表达水平。结果所培养的原代细胞为原代软骨细胞。IL-1β(10ng/ml)处理可显著抑制原代软骨细胞增殖活力,但IL-1β(1、10、20、40 ng/ml)处理对SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力无明显影响。IL-1β(10ng/ml)处理可使IL-6、MMP-13表达水平及NF-κB mRNA的表达量均显著增加。结论IL-1β作用下原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系均可表现出骨关节炎样炎症反应,二者均可用于骨关节炎的体外实验研究。     

miR-382-3p靶向RASA1基因调控骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡

目的:探讨mi R-382-3p对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法:用100 ng/mL的脂多糖(LPS)处理软骨细胞,记为LPS组,以正常培养的软骨细胞作为正常对照(NC)组。mi R-NC、mi R-382-3p、anti-miR-NC、anti-miR-382-3p转染至软骨细胞中,记为mi R-NC组、mi R-382-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-382-3p组;将mi R-NC、mi R-382-3p、si-NC、si-RASA1转染至软骨细胞后再用100 ng/mL的LPS处理,记为mi R-NC+LPS组、mi R-382-3p+LPS组、si-NC+LPS组、si-RASA1+LPS组;将mi R-382-3p分别与pcDNA-NC、pcDNA-RASA1共转染至软骨细胞后再用100 ng/mL的LPS处理,记为mi R-382-3p+pcDNA-NC+LPS组、mi R-382-3p+pcDNA-RASA1+LPS组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测mi R-382-3p和Ras p21蛋白活化因子1(RASA1)m RNA表达水平;蛋白质印迹(Western blot)法检测RASA1、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)蛋白表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡;荧光素酶报告实验检测mi R-382-3p和RASA1的靶向关系。结果:LPS诱导的软骨细胞中mi R-382-3p表达水平显著降低,RASA1表达水平显著升高,CyclinD1表达水平显著降低,Cleaved-caspase-3表达水平显著升高,细胞存活率显著降低,细胞凋亡率显著升高(P0.05)。过表达mi R-382-3p和敲减RASA1,LPS诱导的软骨细胞中CyclinD1表达水平显著升高,Cleaved-caspase-3表达水平显著降低,细胞存活率显著升高,细胞凋亡率显著降低(P0.05)。mi R-382-3p靶向调控RASA1,高表达RASA1部分逆转了mi R-382-3p高表达对LPS处理的软骨细胞增殖和凋亡的影响。结论:过表达mi R-382-3p促进软骨细胞增殖,抑制LPS诱导的软骨细胞凋亡,其机制可能与RASA1有关。