苏云金杆菌Bt33发酵条件优化及应用于烟草粉螟防治的研究

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Bt33菌株是从736株野生型Bt菌中筛选分离的1株对烟草粉螟具有高效杀虫活性的菌株,鉴定为科尔默亚种。本研究对Bt33菌株进行了初始接种量、培养基及发酵条件优化,晶体蛋白质电镜观察和SDS-PAGE分析,在室内及烟叶仓库中进行了防治效果测定,对施用Bt33后的烟叶进行了化学成分分析及单体烟评吸。结果表明,应用Bt33防治烟草粉螟效果好;对烟叶的化学成分影响不大;单体烟评吸分显著高于对照,用Bt33防治烟叶仓库害虫烟草粉螟有一定的发展潜力。     

苏云金杆菌幕虫亚种菌株的特性研究

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Bt53菌株是一株对仓库害虫具有高效杀虫活性的菌株,为其能在生产上有效控制仓储害虫,作者分别采用液体培养法、SDS-PAGE、喷雾处理等方法就该菌株的培养、生化及杀虫活性进行了系统的研究。研究结果表明在摇瓶培养条件下菌株Bt53优化培养基：玉米粉0．5%、黄豆粉2．0%、酵母粉0．10%、蛋白胨0．75%、磷酸二氢钾0．75%、碳酸钙0．15%;硫酸镁0．035%,培养时间40h,pH7．5,转速180r/mim,温度30℃为该菌株最佳培养条件。通过生化测定初步确定Bt53菌株为幕虫亚种。Bt53菌株晶体有菱形、长椭圆形、不规则形晶体及镶嵌形晶体,晶体大小不均,可产生分子量为43kD、15kD、19kD的晶体蛋白质。菌株Bt53对烟草粉螟二龄幼虫的室内防效以9d后发酵原粉稀释100、300倍的防效最好,超过80%。烟叶仓库中使用烟叶均匀喷雾处理比烟包表面喷雾处理效果稍好,防效较高。Bt53菌剂对烟叶的化学成分影响不大。用Bt53菌株防治烟叶仓库害虫有巨大的发展潜力。     

从湖北神农架原始森林土壤中分离的高毒力苏云金芽孢杆菌

从神农架原始森林土壤中分离出苏云金芽孢杆菌 9株。经过生理生化和血清学鉴定 ,此 9株苏云金芽孢杆菌分属于H7、H6和H14。生物测定结果表明 :两株H7型菌株对棉铃虫幼虫有较高的毒力 ;另两株对致倦库蚊幼虫和白纹伊蚊幼虫有很强的毒杀作用 ,此两株属苏云金芽孢杆菌H14。     

小菜蛾高效Bt菌株的分离、生化特性及基因型鉴定

从哈尔滨田间采集死亡小菜蛾Plutella xylostella（L.）幼虫,从中分离出10株苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis。对小菜蛾幼虫室内生物测定结果表明,各菌株对小菜蛾幼虫的死亡率均在85%以上,其中DBW902毒力最强,48h的LC50为13.99mg/L。菌株cry/cyt基因检测表明,所有菌株均含有cry1A或cry2A基因,这与其高毒力的特性基本吻合。生化检测与分析表明,菌株DBW904、DBW93、DBW962与已报道的苏云金芽孢杆菌山东亚种B.thuringiensis subsp.shandongiensis的生化特性一致,但是其它菌株的生理生化特性与已报道菌株有区别。     

云南烟叶中苏云金杆菌的分布及杀虫特性

采用4%NaCl培养基选择分离法,从云南7个生产烟区采集的450个复烤烟样中,分离出苏云金芽孢杆菌475株。分离出的Bt菌进行PCR毒素蛋白基因鉴定,其中含cryI毒素蛋白基因的Bt菌有7株,出菌率为1.47%;含cryV毒素蛋白基因的Bt菌11株,出菌率为2.32%;没有含cryⅢ毒素蛋白基因的Bt菌。对含毒蛋白基因cryⅠ及cryⅤ的18个Bt菌株用二龄烟草甲虫进行生物毒力测定,试验后9d有9个Bt菌件生物毒力测定校正死亡率均超过80%;试验后12d有5个Bt菌株生物毒力测定校正死亡率均超过95%。可见,用苏云金芽孢杆菌防治烟叶仓贮害虫是有潜力的。     

苏云金芽孢杆菌毒蛋白发掘方法的研究进展

自上世纪初发现苏云金芽孢杆菌对昆虫有杀虫活性以来,如何发掘利用苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白服务于农业生产和人类的卫生防控就成为一个重要课题。从早期的分离菌株使用菌体的复合物喷施到使用分子手段转化植物特定表达,人类在苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的利用精准度上在不断提高,但随之而来就是抗性的产生。因此不断发掘可使用的新的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因资源就是一个很重要的话题。本综述就苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的发掘方法研究做一系统论述。     

对韭菜迟眼蕈蚊幼虫高毒力Bt资源筛选及效果评价

【目的】为开发防治韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga的生物杀虫剂,本研究评价了185株苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis对韭菜迟眼蕈蚊幼虫的杀虫活性。【方法】采用浸叶饲喂法对供试菌株进行室内生物学测定,用盆栽试验对筛选到的对韭菜迟眼蕈蚊高毒力的FPT3菌株进行防效验证,通过SDS-PAGE电泳技术对FPT3菌株的杀虫晶体蛋白进行分析,并采用Biolog微生物自动分析系统对FPT3菌株进行了生理生化测定。【结果】在1×10~8 cfu/m L浓度下,对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫3 d的校正死亡率在80%以上的菌株有12株,其中FPT3菌株对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫的杀虫活性最高;FPT3菌株表达70 ku左右蛋白,具有典型的苏云金芽胞杆菌的生理生化特征;FPT3菌株对韭菜迟眼蕈蚊1龄和2龄幼虫具有较高的杀虫活性,LC_(50)分别为1.206×10~6 cfu/m L和2.577×10~6 cfu/mL,室内盆栽试验明确了FPT3菌株对韭菜迟眼蕈蚊的防治效果达77.76%。【结论】FPT3菌株能有效地控制韭菜迟眼蕈蚊的发生,具有良好的应用前景。     

曾候乙墓穴木椁微生物的分离与鉴定

从曾侯乙墓中椁室、东椁室、西椁室和北椁室分别取样,经平板划线培养,分离,纯化共获得典型的菌株16株。将16株分别涂片镜检,生理生化分析鉴定,结果证明芽孢杆菌属11株,其中苏云金变种1株,地衣芽孢杆菌1株,巨大芽孢杆菌1株,球形芽孢杆菌5株,蜡状芽孢杆菌2株,多粘芽孢杆菌1株。其余菌株微杆菌属4株,黄色杆菌属黄杆菌1株。     

苏云金杆菌的一个新生物型—SD—5菌株

从霜天蛾病死幼虫中分离到1株能形成伴孢晶体毒素的芽孢杆菌,杀虫效力和发酵性能优良,经生理生化特性测定和血清学研究,SD-5菌株的晶体蛋白特性不同于7216和HD-1菌株,属于库斯塔克亚种(H303b)的1个新生物型.     

津巴布韦烟叶中淀粉酶和蛋白酶产生菌的分离及鉴定

目的:从津巴布韦烟叶中分离产蛋白酶菌和产淀粉酶能力最高的菌株,并对其进行鉴定。方法:采用淀粉富集培养基和酪蛋白富集培养基分别分离津巴布韦烟叶中的产淀粉酶和产蛋白酶菌株,通过生理生化实验和16SrRNA序列分析鉴定分离的菌株。结果:产蛋白酶菌株菌体不透明、表面有褶皱,蛋白酶酶活为52.10±0.13 U/mL;产淀粉酶菌株菌体表面呈黏状,淀粉酶酶活为3.69±0.07 U/mL;产蛋白酶与产淀粉酶的2株菌均与枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列有100%的相似性,结合生理生化指标初步鉴定为枯草芽孢杆菌。结论:获得的2株菌在降解烟叶的蛋白质和淀粉过程中可能起重要作用。     

绿色荧光蛋白基因原核表达载体的构建及其在昆虫肠道短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的表达

【目的】构建带有苏云金芽孢杆菌cry3a基因非芽孢依赖启动子和绿色荧光蛋白基因gfp(Green Fluorescent Protein)的原核表达载体,并转化从桑粒肩天牛幼虫肠道分离的两株常驻细菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,以检测cry3a启动子在昆虫肠道常驻菌中的启动子活性,获得GFP标记菌株,为常驻菌在昆虫幼虫肠道中的定殖情况和杀虫工程菌的构建奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR将cry3a基因启动子和gfp基因进行融合,并与pHT304载体连接构建重组质粒pHT3AG,获得的重组质粒以电脉冲转化肠道常驻菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,于可见光和荧光显微镜下观察荧光并通过SDS-PAGE分析重组菌株的蛋白表达情况,然后对重组菌株进行生长动力学分析和稳定性测试。【结果】重组菌在营养期大量组成型表达GFP,经电泳分离在凝胶上出现约29kDa的特异蛋白条带;重组菌生长曲线与出发菌没有显著差异,说明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响;抗性条件下传代30次后两菌株外源质粒稳定性仍可达95%、67%;两个菌株比较,CQUBb比CQUBt质粒转化率高、重组菌GFP表达时间长、表达量大,并且重组菌株稳定性好。【结论】成功地将cry3a基因核心启动子和gfp基因转入桑粒肩天牛幼虫肠道常驻菌,实现了该启动子在Bt之外的菌株中发挥作用,构建了两个GFP标记菌株;重组基因工程菌株表达量大,稳定性好,可以用作昆虫肠道内微生态研究和芽孢杆菌表达系统以及杀虫菌株的构建。     

一株有抑菌活性海洋放线菌的筛选及鉴定

目的:筛选具有抑菌活性的海洋放线菌.方法:以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白假丝酵母、黑曲霉、苏云金芽孢杆菌、副溶血弧菌、胶质芽孢杆菌作为指示菌,采用滤纸片法进行筛选,将筛选到的菌株进行培养特征研究、生理生化试验及16S rDNA序列分析,并将测序结果提交至NCBI进行相似性检索,进而绘制出系统进化树,得到鉴定结果.结果:从舟山海域分离到1株具有较好抑菌活性的放线菌菌株a10,鉴定结果显示a10是一株浅玫瑰色链霉菌突变株.     

黑龙江省苏云金杆菌的分离及对夜蛾科昆虫高毒力菌株的筛选

【目的】为了发掘新的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的资源,在黑龙江省不同地区采集不同类型的土壤样品分离出对夜蛾科具有高毒力的菌株。【方法】采用醋酸钠选择性筛选法筛选Bt菌株,利用10对通用引物对分离株进行基因型分析,SDS-PAGE进行杀虫晶体蛋白分析,同时测定苏云金杆菌分离株对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)、甘蓝夜蛾Mamestra brassicae(Linnaeus)、斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)的杀虫活性。【结果】从黑龙江省不同地区采集的352份不同类型的土壤样品中,共分离出46株苏云金芽孢杆菌野生菌株,出菌率为13.06%。油镜下可观察到伴孢晶体的形态有菱形、球形、镶嵌形及不规则形。结果表明产菱形晶体的菌株多含有cry1类基因,而同时产生菱形、球形及不规则形晶体的菌株则含有多种基因型。SDS-PAGE蛋白分析发现这些菌株主要表达130、90、60 ku蛋白。对其中的部分菌株进行毒力测定,结果表明有4株菌株对3种夜蛾科昆虫具有高毒力。【结论】黑龙江省苏云金芽孢杆菌分布广泛,类型多样,已获得对夜蛾科昆虫有高毒力的菌株,这对夜蛾科害虫的绿色防控及延缓其抗性具有重要意义。     

苏云金杆菌cry 1C基因检测及其与杀虫活性的关系

对实验室分离保存的 5 4株苏云金芽孢杆菌的H 血清型、杀虫晶体蛋白质 ,杀虫基因cry 1C和对甜菜夜蛾的活性进行了检测 ,分析了它们之间的关系。结果表明 ,有 2 8株菌株含有cry 1C基因 ,携带有cry 1C基因的菌株的晶体蛋白质主要为 135ku左右 ,它们对甜菜夜蛾均有较高的毒性 ,这些菌株的鞭毛抗原血清型主要分布在H 5和H 7。     

苏云金芽孢杆菌的一个新亚种(Btsubsp.sinensis)

198 9年自云南昆明市石林的红棕壤中分离到数株苏云金芽孢杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ,Ｂｔ)菌株[1] ,对其中的一株ＹＫ30 0 4进行了生物学特性、杀虫特性研究及分类鉴定。1　材料与方法1.1　供鉴定的Ｂｔ菌株由云南昆明市石林的红棕壤中分离的苏云金芽孢杆菌ＹＫ30 0 4菌株。1.2　标准Ｂｔ菌株血清型Ｈ1 Ｈ4 1、Ｈ4 4 Ｈ55及Ｈ57 Ｈ69标准Ｂｔ菌株由法国巴斯德研究院ＤｒＬｅｃａｄｅｔ提供 ,其余为本实验室保存。1.3　生物测定用昆虫小菜蛾 (Ｐｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ) 3龄幼虫 ;斜纹夜盗蛾 (Ｐｒ…     

对金龟子具有杀虫专一性的苏云金芽孢杆菌综述(英文)

自从 190 1年Ishiwata首次报导猝倒菌以来 ,已有数千篇有关苏云金芽孢杆菌的论文相继发表。在苏云金芽孢杆菌 (Bt)的害虫生物防治领域中首次发现对鳞翅目昆虫有杀虫专一性的Bt菌株以后 ,又有了划时代的进展。Goldberg和Margalit发现了杀双翅目幼虫的以色列亚种 (subsp .isrealensis) ,以及Kreig等人发现了对某些鞘翅目幼虫有毒的拟步行甲亚种 (sbusp .tenebrionis)。 1992年 ,Ohba等分离到了日本亚种(subsp .japonensis)对金龟子有专一性杀虫作用的菌株Buibui。该菌株及与之有关的研究进展即是本文讨论的重点。这些发现不仅丰富了苏云金芽孢杆菌科学 ,也丰富了生物防治的应用策略。另一方面 ,在毒素蛋白结构及其杀虫机制的分子生物学和生物化学领域也已获巨大进展。但对杀虫机制尚未完全明了。例如 ,对杀虫蛋白与中肠上皮细胞原生质膜上的受体蛋白的相互作用就知之甚少。这一领域在某种程度上还是众说纷纭。展论这些令人兴奋而又难解的课题将最终促成二十一世纪可持续农业的建立。     

芽孢杆菌BRC-XYT1菌株的分离和鉴定及其对松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)的杀虫活性

从枯死木中分离出一株对松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)幼虫有毒力作用的菌株BRC-XYT1,基于形态学鉴定、生理生化反应、16S rDNA系统发育分析,鉴定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)的一个菌种。经药敏分析测试显示,其对于一些常见药物有着不同程度的敏感性。此外,基于生物测定数据,该菌株对松墨天牛幼虫表现出显著的杀虫活性。研究结果为控制松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)储备了新资源,为开拓新型微生物农药提供了理论基础。     

片烟产果胶酶细菌的鉴定及酶活测定

以果胶为碳源, 对津巴布韦片烟烟叶表面产果胶酶细菌进行分离, 采用16S rDNA限制性酶切片段长度多态性分析(ARDRA)和测序方法, 结合形态学、生理生化实验, 对所分离产果胶酶菌株进行鉴定, 同时研究培养时间、温度、起始pH、接种量对菌株产酶的影响。结果表明, 从津巴布韦片烟烟叶表面分离得到的产果胶酶菌株主要为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和产碱菌属的粪产碱菌Alcaligenes faecalis。在所分离的菌株中, 枯草芽孢杆菌T10酶活力最高, 以6%的接种量, 在温度为35 °C、起始pH为7.5条件下培养48?56 h, 其果胶酶酶活为571 U/mg, 聚半乳糖醛酸裂解酶酶活为297 U/mg。     

利用PCR技术直接鉴定苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型的快速方法

根据PCR程序中热变性温度可使菌体裂解,释放出DNA的原理,利用苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白不同基因型的特异混合引物,对苏云金芽孢杆菌营养体直接进行PCR分析。根据不同基因型的特异扩增产物片段的分子量大小便可直接确定该苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的基因型。本文对本室筛选天然菌株和苏云金芽孢杆菌克隆菌株分别进行了cryl基因的PCR分析。表明,该法结果可靠快速易行,在方法学上,为苏云金芽孢杆菌菌株鉴定、新菌株的筛选和基因型分析提供了极大的方便。     

抗夜蛾科苏云金芽孢杆菌WY-197菌株的生物学特性研究

苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)WY 197菌株是从 4 0 0多株野生型Bt菌中筛选分离的1株对甜菜夜蛾和棉铃虫都具有高效杀虫活性的菌株。初步比较WY -197菌株和HD 1的形态特征、生理生化特性和伴孢晶体蛋白 ,结果表明 ,WY -197属于H3a3b3c血清型 (subsp .kurstaki) ;伴孢晶体形态主要为大小不一的菱形、小正方形。SDS -PAGE电泳图谱表明主要由 135ku和 6 5ku两种蛋白成分组成 ,在菌株生长形态、发酵培养特征、生理生化特性方面与生产菌株HD-1差别不大。采用生物测定的方法 ,进一步鉴定比较它们对甜菜夜蛾初孵、二龄、三龄幼虫和棉铃虫的毒效差异。结果表明 ,BtWY 197菌株发酵液对甜菜夜蛾初孵、二龄、三龄幼虫的LC50 分别为 0 .31、0 .6 1、2 .5 7μL/mL ,其中对甜菜夜蛾初孵幼虫的毒效是对照菌HD 1发酵液的 7倍 ,表明BtWY 197菌株对甜菜夜蛾三龄以下幼虫具有高毒力。对棉铃虫的毒力效价为 30 0 0IU/ μL ,略低于HD- 1菌株。