成纤维细胞生长因子（FGF）受体-2参与FGF-21介导的糖代谢活性米

最近发现,FGF-21具有很强的调节血糖和血脂的作用,已经成为糖尿病研究领域的新热点,但是其功能受体和作用机制还不清楚．前期结果表明,FGF-21促进3T3L1脂肪细胞代谢葡萄糖,对前脂肪细胞无作用,说明脂肪细胞表达FGF-21功能受体．以3T3L1脂肪细胞为靶标,旨存寻找FGF-21的功能受体．结果表明,FGF-21可与3T3L1脂肪细胞膜蛋白形成FGF-21／受体复合物,免疫检测结果发现,FGF-21／受体复合物中含有FGF受体-2（FGFR-2）．为明确FGF-21／FGFR-2的特异性关系,系统研究了FGFR-2对FGF-21刺激后的酪氨酸磷酸化反应．结果表明,虽然前脂肪细胞和脂肪细胞均表达FGFR-2,但是FGF-21只诱导脂肪绌胞中表达的FGFR-2磷酸化,对前脂肪细胞表达的FGFR-2无作用,与葡萄糖吸收试验相符．FGF-21不仅可使原位表达的FGFR-2磷酸化,还可使异位表达的FGFR-2磷酸化,克隆后测序分析结果表明,FGFR-2Ⅲc是3T3L1脂肪细胞表达的主要FGFR-2类型．这些结果提示,FGFR-2Ⅲc是FGF-21的功能受体,参与FGF-21在脂肪细胞介导的糖代谢活性．此外,系统分析了FGFR-2在3T3L1分化过程巾的差异表达,为FGF-21在前脂肪细胞和脂肪细胞中的功能差异提供了依据．     

成纤维细胞生长因子(FGF)受体-2参与FGF-21介导的糖代谢活性

最近发现,FGF-21具有很强的调节血糖和血脂的作用,已经成为糖尿病研究领域的新热点,但是其功能受体和作用机制还不清楚．前期结果表明,FGF-21促进3T3L1脂肪细胞代谢葡萄糖,对前脂肪细胞无作用,说明脂肪细胞表达FGF-21功能受体．以3T3L1 脂肪细胞为靶标,旨在寻找FGF-21的功能受体．结果表明,FGF-21可与3T3L1脂肪细胞膜蛋白形成FGF-21/受体复合物,免疫检测结果发现,FGF-21/受体复合物中含有FGF受体-2(FGFR-2)．为明确FGF-21/FGFR-2的特异性关系,系统研究了FGFR-2对FGF-21刺激后的酪氨酸磷酸化反应．结果表明,虽然前脂肪细胞和脂肪细胞均表达FGFR-2,但是FGF-21只诱导脂肪细胞中表达的FGFR-2磷酸化,对前脂肪细胞表达的FGFR-2无作用,与葡萄糖吸收试验相符．FGF-21不仅可使原位表达的FGFR-2磷酸化,还可使异位表达的FGFR-2磷酸化．克隆后测序分析结果表明,FGFR-2Ⅲc是3T3L1脂肪细胞表达的主要FGFR-2类型．这些结果提示,FGFR-2Ⅲc是FGF-21的功能受体,参与FGF-21在脂肪细胞介导的糖代谢活性．此外,系统分析了FGFR-2在3T3L1分化过程中的差异表达,为FGF-21在前脂肪细胞和脂肪细胞中的功能差异提供了依据．     

人源NOVA1蛋白的真核表达及其抗低氧活性鉴定

构建人NOVA1基因的真核表达载体pCMV-Myc-NOVA1,转染PC12细胞后筛选最佳转染条件,进而结合细胞免疫组织化学研究NOVA1蛋白在PC12细胞中的表达分布,并探究其抗低氧活性。根据NCBI数据库NOVA1基因序列设计上下游引物,以pCR4-TOPO-NOVA1载体为模板采用聚合酶链式反应扩增获得NOVA1基因的全长c DNA编码序列,限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ双酶切后插入pCMV-Myc真核表达载体,酶切及直接测序验证后采用脂质体转染法转染入PC12细胞,针对转染比例和转染时间进行优化,进而采用实时定量PCR和Western blotting检测NOVA1蛋白的表达,最后采用细胞免疫组织化学检测NOVA1蛋白在PC12细胞中的表达定位及其抗低氧活性。通过酶切和直接测序验证,成功构建了真核表达载体pCMV-Myc-NOVA1;质粒和Lipo2000最佳转染比例为1:2.5,最佳转染时间为72 h;最佳转染条件下NOVA1基因和蛋白的表达水平显著增加,转染pCMV-Myc-NOVA1质粒后,NOVA1蛋白主要分布于细胞核和细胞质;过表达NOVA1的PC12细胞增殖活性明显增加。本文采用分子克隆的方法成功构建了NOVA1基因的真核表达载体,通过条件优化实现了高效表达并测定过表达NOVA1蛋白具有明显的抗低氧活性,不仅为深入揭示NOVA1蛋白的作用机理提供了重要参考,而且为NOVA1蛋白潜在的药物开发提供了重要技术支撑。     

GNA成熟蛋白基因亚克隆及其原核表达载体构建

雪花莲外源凝集素（GNA）对刺吸式昆虫和某些咀嚼式昆虫以及多种线虫均有毒性,从含GNA前体蛋白基因的质粒中亚克隆出GNA的成熟蛋白基因MGNA,将MGNA基因插入大肠杆菌表达载体pET22b的不同位点,再经测序验证,得到了三种不同表达形式的GNA原核表达载体;22bG1(分泌型融合GNA蛋白）,22bG2(包涵体型GNA蛋白）,22bG3(分泌型天然GNA蛋白）,这为进一步在大肠杆菌中表达GNA和将GNA制成生物农药奠定了基础。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建

以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒.酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子.重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100％相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带.     

香蕉胁迫相关蛋白基因的克隆及其表达分析

通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得胁迫相关蛋白基因,命名为MaSAP1(GenBank登录号为AGH14257.1)。扩增获得的cDNA序列与质粒OZ092的目的片段序列一致,表明MaSAP1是香蕉SAP基因编码框全长cDNA,包含一个510bp的最大开放阅读框,编码一个长169个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的A20和AN1基序结构。系统进化树比对分析表明,MaSAP1与水稻和獐茅的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaSAP1基因在香蕉根和果实中的表达量较高,在茎中的表达量最低。实时荧光定量PCR分析表明MaSAP1响应激素的处理,同时也响应干旱、低温、高盐和枯萎病菌的侵染等胁迫。可见,MaSAP1基因在植物生长发育和植物响应逆境中具有重要作用。     

人表皮生长因子基因的化学合成和克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了人表皮生长因子基因,全长为173个核苷酸,它被分成8个寡核苷酸,分别在DNA合成仪上合成。经分离纯化后的寡聚核苷酸进行酶促连接,然后被克隆到噬菌体M13mpl8中,克隆经分子杂交、限制酶酶切以及DNA序列分析检测,证明合成的人表皮生长因子基因和设计的完全一致。将人表皮生长因子基因的DNA片段插入酵母分泌型表达载休YFD59 HindⅢ位点中,建成表达人表皮生长因子基因的质粒YFDl04,再将此质粒转化酿酒酵母,所得转化子经摇瓶发酵,发酵上清液用受体结合试验表明有人表皮生长因子表达。     

大黄鱼ubc9基因的克隆和组织表达

类泛素化(sumoylation)是一种重要的转录后修饰过程.激活的SUMO(small ubiquitin-related modifer)和E2结合酶结合稳定后共价结合到底物上,从而完成对底物的类泛素化.UBC9(ubiquitin-conjugating enzyme)作为惟一的E2结合酶,在完成类泛素化中起着重要作用.从已构建的大黄鱼性腺线性化cDNA文库中筛选出ubc9同源片段,用SMART-RACE方法克隆得到了846 bp的全长cDNA序列.该序列编码一个由158个氨基酸组成的蛋白.该蛋白序列与已知的UBC9高度同源,含UBC保守结构域和UBC9激活位点区域.实时定量PCR分析ubc9基因在各组织器官的表达,结果发现,ubc9基因在大黄鱼的性腺中大量表达.推测UBC9在大黄鱼性腺发育中起重要的生物学作用.     

聚乙二醇修饰的成纤维细胞生长因子-21的降血糖作用

成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)是FGF家族的一员．现有大量研究表明,FGF-21是除胰岛素以外的一种新的血糖调节因子,有望成为治疗2型糖尿病的新型药物．然而,FGF-21在动物体内稳定性较差,半衰期较短,严重影响了其在临床上的应用．为解决这些问题,本实验采用分子质量为20 ku的单甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)对鼠源FGF-21(mFGF-21)进行N端定点修饰,以改善mFGF-21的性质(如提高体内半衰期、降低免疫原性等)．本文研究了反应pH、反应时间、蛋白质浓度及反应物之间的质量比对mFGF-21与聚乙二醇(PEG)合成反应的影响．采用Capto Q阴离子交换层析或Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化聚乙二醇化mFGF-21(PEG-mFGF-21),并最终确定了mFGF-21 聚乙二醇修饰的反应条件和分离PEG-mFGF-21的纯化工艺．随后分别进行了PEG-mFGF-21的理化性质(大小、纯度和体外稳定性)、免疫原性、体内半衰期、体外葡萄糖吸收活性及体内降糖活性的研究．体外稳定性实验结果显示,mFGF-21经PEG修饰后温度稳定性和抗蛋白酶水解稳定性都显著提高．间接ELISA方法检测血清中mFGF-21抗体水平及目标蛋白含量的结果表明,PEG修饰mFGF-21可明显降低其免疫原性,延长体内半衰期．HepG2细胞的葡萄糖吸收实验结果发现,PEG-mFGF-21的细胞活性并没有下降,反而随着刺激细胞时间的延长,经PEG-mFGF-21刺激的细胞葡萄糖吸收显著高于mFGF-21刺激的细胞葡萄糖吸收．2型糖尿病db/db小鼠短期血糖调控实验结果表明,mFGF-21降糖速度快于PEG-mFGF-21,但其持续时间较PEG-mFGF-21短;长期血糖调控实验结果显示,PEG-mFGF-21长期降糖效果优于mFGF-21,作用持续时间长,并且PEG-mFGF-21在停药后控制血糖的能力也高于mFGF-21．综上所述可知,mFGF-21的PEG修饰在不影响其体外生物活性的前提下,能够提高mFGF-21的物理稳定性和抵抗蛋白酶水解的能力、降低免疫原性、增加体内稳定性、延长mFGF-21在动物体内降血糖作用的效果和时间．本实验为FGF-21化学修饰提供了重要的技术平台,对以后FGF-21的临床应用具有非常重要的意义．     

成纤维细胞生长因子(FGF)-21改善胰岛素抵抗肝细胞对葡萄糖的吸收和肝糖原的合成

在体外建立胰岛素抵抗肝细胞模型,探讨在胰岛素抵抗状态下成纤维细胞生长因子(FGF)-21对模型细胞糖代谢的影响及机制．将HepG2细胞置于10^-7 mol/L 的胰岛素培养基中培养24 h,建立胰岛素抵抗细胞模型．分别用不同浓度的胰岛素和FGF-21处理模型细胞,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法检测细胞对葡萄糖的摄取情况,并检查胰岛素与FGF-21的协同作用．利用实时荧光定量PCR检测FGF-21对模型细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)mRNA表达的影响,蒽酮法检测模型细胞糖原合成量,探讨FGF-21对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖摄取的影响及机制．结果发现,用高浓度胰岛素处理HepG2细胞24 h后,细胞对胰岛素的敏感性显著降低,说明成功建立了胰岛素抵抗细胞模型,抵抗状态可维持48 h,未发现细胞形态学变化．FGF-21能改善胰岛素抵抗模型细胞的葡萄糖摄取,参与肝糖原的合成,并与胰岛素产生协同作用．实时荧光定量PCR结果发现,FGF-21作用模型细胞后,细胞的GLUT1 mRNA表达量显著增加,说明FGF-21促进模型细胞摄取葡萄糖的作用机制与其增加GLUT1的表达有关．     

成纤维细胞生长因子21在抵抗素引发胰岛素抵抗的肝细胞模型中的糖代谢调节作用

抵抗素是2001年Steppan等发现的一种与胰岛素抵抗有密切联系的细胞因子．本研究探讨了成纤维细胞生长因子21(FGF-21)在抵抗素过表达导致胰岛素抵抗的肝细胞中的糖代谢调节作用．构建人抵抗素真核表达载体,转染HepG2细胞,利用流式细胞仪筛选出过表达抵抗素的HepG2模型细胞,分别用不同浓度的胰岛素和FGF-21刺激细胞,用GOD-POD法检测细胞的葡萄糖摄取情况,利用实时荧光定量PCR方法检测抵抗素转染后及FGF-21处理后细胞GLUT1、PPAR-γ mRNA表达的变化．PCR鉴定结果表明过表达抵抗素的HepG2模型细胞构建成功．GOD-POD法检测结果证明,模型细胞对胰岛素敏感性降低,但FGF-21仍能有效调节模型细胞的葡萄糖摄取,且呈现剂量依赖关系．实时荧光定量PCR方法检测发现,抵抗素转染后HepG2细胞GLUT1 mRNA表达增加,经FGF-21刺激后模型细胞与对照细胞相比GLUT1 mRNA的表达仍有上升趋势,PPAR-γ的变化不显著．上述结果表明,抵抗素过表达的肝细胞,对胰岛素敏感性降低,产生胰岛素抵抗,但FGF-21仍能有效调节其葡萄糖代谢．     

脓毒症患者血清FGF-21、MR-proADM、炎性因子与预后的关系分析

目的:探讨血清人成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)、肾上腺髓质素前体中段肽(MR-proADM)、炎性因子与脓毒症患者预后的关系。方法:选取2015年9月至2018年9月我院收治的脓毒症患者160例(脓毒症组),按病情严重程度分为轻度脓毒症组(A组)56例、严重脓毒症组(B组)53例,脓毒性休克组(C组)51例,另选取同期50例健康体检者作为健康对照组。检测各组血清FGF-21、MR-proADM和炎性因子[(白细胞(WBC),白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-10(IL-10)]水平,记录脓毒症患者序贯性器官功能衰竭评分(SOFA)和急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分及28 d预后。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析FGF-21、MR-proADM、炎性因子单独及联合评估脓毒症预后的价值。采用Spearman相关分析FGF-21、MR-proADM和炎性因子与APACHEⅡ评分、SOFA评分的相关性。结果:脓毒症组血清FGF-21、MR-proADM和炎性因子WBC、IL-6、TNF-α、IL-10水平均明显高于健康对照组(均P0.05),且随着脓毒症病情的加重,患者血清FGF-21、MR-proADM和炎性因子水平逐渐升高。脓毒症患者中28d死亡43例(26.88%),其中A组8例(14.29%)、B组12例(22.64%)、C组23例(45.10%)。ROC曲线分析显示,联合检测评估脓毒症患者病死率的曲线下面积(AUC)、敏感度及特异度均高于单一检测。脓毒症患者血清FGF-21、MR-proADM、WBC、IL-6、TNF-α与APACHEⅡ评分及SOFA评分均呈正相关性(P0.05),此外,IL-10与SOFA评分呈正相关性(P0.05),与APACHEⅡ评分无相关性(P0.05)。结论:脓毒症患者血清FGF-21、MR-proADM水平升高,检测FGF-21、MR-proADM和炎性因子有助于评估脓毒症患者的病情及预后。     

急性ST段抬高型心肌梗死介入手术时间窗与血清FGF-21水平的相关性

摘要 目的：探究急性ST段抬高型心肌梗死介入手术时间窗与血清FGF-21水平的相关性。方法：选取2019年3月-2021年5月在我院接受PPCI手术并住院治疗且符合STEMI诊断标准的73例患者,根据FGF-21水平高低,将73例患者分为FGF-21低水平组（>140.41 ng/L,n=54例）和FGF-21高水平组（<140.41 ng/L,n=19例）。对比分析两组患者的一般临床资料、急救时间窗和SO-to-FMC时间差异,再通过Spearson法判断急救时间窗与FGF-21水平的相关性。结果：FGF-21低水平组患者的急救时间窗SO-to-FMC、FMC-to-B、D2B和STB均较FGF-21高水平组患者时间长,且SO-to-FMC时间>120 min是导致FGF-21水平变低的危险因素,介入手术时间窗指标与FGF-21水平均呈正相关（r=0.235、0.462、0.298、0.337）。高血压史、糖尿病史、首次医疗接触方式（急诊）和SO-to-FMC均是FGF-21水平变化的独立危险因素,且差异有统计学意义（P<0.05）。结论：SO-to-FMC时间和STB时间延长可能促进STEMI患者FGF-21水平异常,故应严格把握好院外的急救时间。     

益生菌在血糖调控中的作用

随着经济及生活水平的提高，营养过剩导致营养代谢疾病中2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）发生率骤增。患者血糖升高及并发症严重降低生活质量，增加经济负担。现行降糖药存在局限性和副作用，而益生菌具有安全、经济和有效等特点，并且能够降血糖和减轻并发症等。益生菌在糖尿病预防、治疗和重塑肠道微生态健康方面具有良好的应用前景，逐渐成为糖尿病防治的研究热点。虽然益生菌有望攻克糖尿病，但是调控血糖的机制需要更加深入的研究。本文综述了益生菌调控血糖的应用及机制研究、发展趋势与前景及挑战，为调控血糖微生态制剂的开发提供理论基础。     

Fibronectin-mediated adhesion rescues cell cycle arrest induced by fibroblast growth factor-1 by decreased expression of P21cip/waf in human chondrocytes

Summary In chondrocytes, fibroblast growth factors (FGFs) inhibit chondrocytes proliferation by upregulation of the cell cycle inhibitor p21^cip/waf. In this report, we first investigated the roles of fibronectin (FN)-mediated cell adhesion in the modulation of FGF-1's antiproliferative function in chondrocytes. In this study, we found that FN-mediated signaling could rescue cell cycle arrest induced by FGF-1 in primary human chondrocytes. This prevention of cell cycle arrest induced by FGF-1 was due to the suppression of the cell cycle inhibitor p21^cip/waf expression on adhesion to FN and its downstream activation of signaling pathways. Finally, we showed that this rescue induced by FN-mediated adhesion is dependent on the extracellular regulated kinase (ERK) signaling pathway. Taken together, these studies support that, despite FGF-FGF receptor's growth-inhibitory function, the FN-mediated signaling can collaborate to compensate for its negative effect on chondrocytes proliferation, providing evidence for cross talk between signals emerging from these cell surface molecules in chondrocyte.     

Post-translational modification of the RhoGTPase activating protein 21, ARHGAP21, by SUMO2/3

ARHGAP21 is a 217 kDa RhoGAP protein shown to modulate cell migration through the control of Cdc42 and FAK activities. In the present work a 250 kDa-ARHGAP21 was identified by mass spectrometry. This modified form is differentially expressed among cell lines and human primary cells. Co-immunoprecipitations and in vitro SUMOylation confirmed ARHGAP21 specific modification by SUMO2/3 and mapped the SUMOylation site to ARHGAP21 lysine K1443. Immunofluorescence staining revealed that ARHGAP21 co-localizes with SUMO2/3 in the cytoplasm and membrane compartments. Interestingly, our results suggest that ARHGAP21 SUMOylation may be related to cell proliferation. Therefore, SUMOylation of ARHGAP21 may represent a way of guiding its function.