一氧化氮和氧自由基诱导缺氧再给氧心肌细胞凋亡的bcl-2和p53信号通路研究

观察了心肌缺氧再给氧损伤的一氧化氮(nitric oxide, NO)和氧自由基机制. 新生Wistar大鼠心肌细胞置于95% N₂ /5% CO₂环境培养24 h, 然后置于95% O₂ /5% CO₂环境培养4 h造成缺氧再给氧心肌细胞损伤模型. 单纯缺氧组心肌细胞置于95% N₂/5% CO₂环境培养24 h, 但不再给氧. NO供体硝普钠(SNP, 5 mmol/L)、NO合酶抑制剂Nw-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME, 100 mmol/L)和其异构体Nw-硝基-D-精氨酸甲酯(D-NAME, 100 mmol/L)以及超氧化物歧化酶/过氧化氢酶(SOD/CAT, 各100 U/mL)分别于缺氧前加入培养基. 正常对照组心肌细胞置于95% 空气/5% CO₂环境下培养. 结果显示, 缺氧24 h能增加培养介质中NO, 硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和乳酸脱氢酶(LDH)水平, 再给氧降低培养介质中NO和 水平, 增加TBARS和LDH水平. 缺氧上调bcl-2和p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 而再给氧下调bcl-2蛋白表达水平, 上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平. 同时, 缺氧增加心肌细胞凋亡率, 而再给氧增加心肌细胞坏死率. NO供体硝普钠(SNP)增加培养介质中 和TBARS水平, 下调bcl-2蛋白表达而上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 增加DNA断裂、凋亡及坏死细胞率. L-NAME和 SOD/CAT分别降低培养介质中 和TBARS水平, 它们均能上调bcl-2蛋白表达而下调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 抑制DNA断裂、凋亡及坏死细胞率, 而D-NAME则无此作用. 以上结果表明, 在缺氧再给氧所致心肌细胞死亡过程中, NO和氧自由基参与下调bcl-2蛋白表达水平和上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 相应地激发细胞凋亡程序, 并提示一氧化氮及氧自由基诱导心肌细胞凋亡的机制与调节 bcl-2和p53和p21/waf1/cip1信号通路有关.     

透明颤菌血红蛋白的表达对酵母中麦角固醇合成的影响

构建了含透明颤菌（Vistreoscilla）血红蛋白基因vgb和酵母遗传霉素（G418）抗性基因的重组质粒pVgbkanMX4,转化至酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1190中,经过分析,基因vgb在酵母细胞中得到表达。对重组菌和野生菌进行了摇瓶培养及5 L发酵罐培养的研究。在摇瓶实验中,重组菌的麦角固醇产量比野生菌有显著提高,在野生菌中的含量为0.573%、而在重组菌中的产量为1.07%。 经过30 h发酵罐培养的实验,野生菌中麦角固醇含量为0.9%,重组菌中其含量为1.38%,验证了摇瓶实验的结果。结果证明vgb基因有利于酵母中麦角固醇的合成。     

玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）原生质体的分离及转化

玉米大斑病是严重危害玉米生产的一个世界性真菌病害。由于玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）在无性生长过程中迅速产生黑色素,致使原生质体难以分离。测试了包括Fungase、Funcelase、Novozyme、Glucanex、Driselase、Uskizyme、Kitalase在内的7种细胞壁降解酶及其组合、病原菌菌株和培养基对原生质体分离效果的影响。结果表明菌株的培养形态和菌丝的生长状态显著影响原生质体的分离效率;酶组合Kitalase+Glucanex+Driselase, Kitalase+Glucanex和Kitalase+Uskizyme能够有效地分离玉米大斑病菌的原生质体。初步的转化试验表明,质粒pAN71可以用于该病原菌的转化。这些结果将为E.turcicum和Exserohium属其它真菌的基因克隆提供一些有用的信息。     

以染料为底物的Trametes hirsuta降解反应体系的建立*

建立Trameteshirsuta的生长繁殖和对模式染料比布列希猩红脱色降解的反应体系 ,研究表明 :菌的生长与降解活动的适宜温度为 30℃ ,静培养 ;培养基组分对脱色降解的影响不大 ;从便于观察和缩短反应周期考虑 ,土豆液体培养基有明显的优点 ,可作为建立Trameteshirsuta反应体系的首选培养基。菌对比布列希猩红、直接深蓝L 3RB、活性艳蓝X BR、碱性紫 5BN和亚甲基蓝等均有较好的脱色降解效果。     

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制,Bts1m基因的表达由2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southern blot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因,约70%的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明,获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性。     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

海枣曲霉β-葡萄糖苷酶的提纯与性质

通过聚乙二醇6000一磷酸钾缓冲液双相分离,Sephadex G—100凝胶过滤、DEAE-Sephadcx A-50及SE-Se phadex C-50离子交换柱层析等提纯步骤,从海枣曲霉(Aspe rgillutphoenlcis)麦麸培养物抽提液中提纯到凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。该酶的最适pH5．0,最适温度60℃,在pH 4．0--7．5之间及55℃以下稳定。Ag+及Hg2+对该酶有强烈的抑制作用。用SDS-凝胶电泳法及梯度凝胶电泳法测得该酶均分子量分别为118000及195000薄层凝胶等电聚焦法测得其等电点为pH 3.95。     

含庚型肝炎病毒E2基因片段质粒DNA能诱发相当强烈的体液免疫应答

研究了庚型肝炎病毒E2(HGVE2 )基因片段作为DNA疫苗的可行性。将来自于质粒pThioHis-E2编码HGVE2的基因片段 (559bp)亚克隆到质粒pCMV-S中 ,使之和HBsAg基因位于同一阅读框 ,形成重组质粒pCMV-S-E2。用纯化的质粒pCMV-S-E2DNA注射到昆明小鼠后腿四头肌中来免疫小鼠 ,同时用pCMV-S作为对照。间隔 14天再加强一次免疫。在加强免疫后的第 8天眼眶取血。用E2-GST融合蛋白作为固定化抗原 ,通过ELISA检测受试小鼠的体液免疫应答。结果表明 ,用质粒pCMV-S-EDNA免疫的小鼠可以产生很强的体液免疫应答。     

黑麦草(Lolium perenne L.)内生真菌的检测、分离及鉴定*

从多年生黑麦草(LoliumperenneL.)5个品种———SR4000、Pinnacle、Topgun、CalypsoⅡ、Justus中分离出61个菌株。次培养后,所得形态稳定的菌株可分为4个形态群,依据其形态特征及APPCR的结果,确定其中的57个分离菌株为Neotyphodiumlolii。     

应用终末荧光产物的发光效应检测聚丙烯酰胺凝胶上的β-内酰胺酶

本文利用β-内酰胺抗生素经β-内酰胺酶水解后,产生终末荧光产物具有发光效应的原理,首次建立了一种检测聚丙烯酰胺凝胶电泳或等电聚焦电泳后凝胶上β-内酰胺酶的方法。该法快速、简便、灵敏、经济,便于推广,实验证明这种方法可以代替传统的Nitrocefin染色法。     

培养幽门螺旋杆菌的发酵工艺研究

采用摇瓶微需氧培养技术,模拟发酵条件,探讨不同因素（pH、转速、种子菌接种量）对幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori,Hp）生长的影响,优化工艺参数,并级联放大到10L发酵罐发酵,经多次实验,建立了稳定的Hp发酵工艺,24h发酵细菌的最大吸光度A600达3.89,收获菌体湿重达5.2g／L。     

Paenibacillus massiliensis T7固氮基因簇nifBHDKENX的克隆、序列分析及铵和氧对nifB启动子的调控

Paenibacillus massiliensis T7是我室从北京郊区分离的一株革兰氏阳性、产芽孢的固氮菌. 根据GenBank中已发表的多种固氮生物nifH基因序列, 在其保守区域设计一对简并引物, PCR扩增获得324 bp的nifH片段. 用地高辛标记该片段为探针, 对EcoRⅠ和PstⅠ消化的P. massiliensis T7染色体DNA进行Southern杂交, 结果DNA/EcoRⅠ杂交道1.1 kb和9 kb处, DNA/PstⅠ杂交道1.3 kb和8 kb处分别有两条杂交带, 从而初步判断nifH可能有两个拷贝. 在324 bp nifH片段的基础上, 采用反向PCR扩增的方法, 获得了purD和nifBHDKENX基因. 在nifB的上游有一个类似σ⁵⁴型启动子的保守序列, 在该启动子上游有一个类似激活蛋白NifA结合位点. 分析表明, nifBHDKENX可能组成一个转录单元, 共用nifB上游的启动子. 将nifB启动子与报告基因lacZ相融合, 构建成表达载体pnifB-LacZ, 并转化到P. massiliensis T7中, 研究铵和氧对该启动子的表达调控. 结果表明, 在无氧条件下, 铵浓度为0%时, β-半乳糖苷酶的活性最高, 随着铵浓度的增加, 酶活性并没有明显的下降过程, 即使铵浓度达80 mmol/L时, 酶活也相当于无铵时的73.12%, 说明铵对nifB启动子有微弱的抑制作用, 而铵浓度一定, 氧浓度3%时, β-半乳糖苷酶活性最高, 提高氧浓度则酶活性开始下降, 当氧浓度高于20%时, β-半乳糖苷酶活性仅几个Miller单位, 说明氧对nifB启动子有明显的抑制作用.     

青霉NXP25纤维素酶的产生及性质

青霉（Penicillium sp.）NXP25在5％玉米穗轴粉,3％（麦夫）,0.35％氮源10号和0.3％氯化钙组成的液体培养基（起始pH 5.0）中,10％接种量,29℃,280r/min振荡培养72h。在50℃温度下测定,发酵液内切-1,4-β-葡聚糖酶,外切-1,4-β-葡聚糖酶,β-葡糖苷酶和滤纸酶活力分别为841u/mL,13u/mL,24u/mL和46u/mL。各类型酶最适作用条件分别为pH4.8和60℃、pH5.0和50℃、pH4.     

海枣曲霉β-葡萄糖苷酶的催化性质

本文研究了海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)β-葡萄糖苷酶的底物特异性以及不同化学试剂对酶活力的影响。该酶水解对一硝基酚基-β-葡萄糖苷、纤维二糖和水杨素的相对活力分别为100、180和67.3。水解对一硝基酚基β-葡萄糖苷和纤维二糖的Km值分别为0.97mmol／L和1 8mmol／L,Vmax分别为576μmol min-1.mg-1和595μmol.min-1.mg-1.mg-1。Ag+、D-葡萄糖和纤维二糖对酶活力有强烈的抑制作用。Lineweaver—Burk作图法及Dixon作图法表明D-葡萄糖对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki值分别为30mmol／L和3．4mmol／L。     

菜豆重金属响应基因PvSR2在烟草中的表达及镉抗性分析

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related)是从法国菜豆中克隆出来的, 为了研究该蛋白能否提高植物的抗重金属能力, 将PvSR2基因插入到植物转化中间载体pCAMBIA2301中CaMV 35S启动子的下游, 用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入烟草中, 在含有100 mg/L Kan的MS培养基上筛选, 获得了转基因植株. PCR和Southern杂交结果表明PvSR2已整合在烟草基因组中, GUS和Northern分析表明PvSR2在转基因烟草中获得表达. 重金属抗性实验表明: 与野生型烟草相比, PvSR2转基因烟草具有较高的抗重金属镉(Cd)的能力. 组织Cd含量分析显示: 在低浓度Cd (0.5~0.75 mmol/L)处理时, Cd在PvSR2转基因烟草与野生型烟草根中的累积量没有明显的差别, 而在高浓度Cd(0.1 mmol/L)胁迫下, 转基因烟草根中Cd的累积量低于野生型烟草, 说明PvSR2的表达能够提高植物的抗重金属能力, 同时表明PvSR2可能与重金属在植物中的运输和积累有一定关系.     

水稻小穗分化调控基因fzp(t)的遗传分析和分子标记定位

从V20B/花1B杂交后代中发现了水稻小穗分化受阻的突变体fzp. fzp株叶形态正常, 但植株分蘖数明显减少, 最显著的变异是fzp植株的小穗分化完全被阻断, 在正常植株枝梗分化为小穗的部位, fzp植株却形成一团枝梗. 遗传分析表明,fzp受一对隐性基因控制, 其相应基因拟名为fzp(t). 显然fzp(t)是控制小穗分化的关键基因. 在一些F2群体中, 因遗传背景发生改变, 部分突变型植株表现为“中间类型”, 推测可能是冗余基因或其他修饰基因、互作基因的作用. 采用微卫星标记技术和BSA分析方法, 将突变基因fzp(t)定位于第7染色体上的长臂末端, 其中RM172和RM248位于fzp(t)一侧, 它们与fzp(t)的遗传图距分别为3.3和6.4 cM; RM18和RM234位于fzp(t)的另一侧, 与fzp(t)的遗传距离分别为23.1和25.3 cM. 研究结果为进一步对该基因的克隆和功能研究奠定了基础.     

热带假丝酵母细胞内pH的测定及其与生长代谢活性的关系

应用荧光探针5(6)-双醋酸羧基荧光素 (Carboxyfluorescein diacetate) 测定了产长链二元酸热带假丝酵母 (Candida tropicalis) 细胞内pH (pHi) 值,确定了该探针载入C. tropicalis细胞的适宜条件。用摇瓶培养C. tropicalis细胞,考察了细胞外pH和生长碳源对pH_I的影响,实验结果表明：细胞外pH对pH_I略有影响,而生长碳源对pH_I的影响略为明显。利用5L发酵罐进一步研究了细胞生长代谢活性与pHi的关系,结果表明：细胞比生长速率、CO₂比生产速率和葡萄糖比消耗速率与pHi变化密切相关,pH_I的增加伴随着细胞生长活力的增加,反之亦然。在pH6.0条件下用葡萄糖和醋酸钠共作碳源培养C. tropicalis细胞时,测得的pH_I值维持在5.72～6.15范围内。     

长沙市2889例3月～16岁儿童幽门螺旋杆菌感染现状及对生长发育的影响分析

本研究对长沙市2889名3月~16岁无症状体检儿童进行了生长发育评估,并通过胶体金法检测了其血清幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)IgG水平。结果显示共检测的2889名儿童(男童1652名,女童1237名)中幽门螺旋杆菌感染阳性765名(26.4%),男童432名(26.2%),女童333(26.9%)。各年龄组幽门螺旋杆菌感染率分别为3月~1岁为31.8%、1岁~3岁为31.4%、3岁~6岁为18.9%、6岁以上15.4%。采用卡方检验及非参数检验进行统计,结果显示男女两组儿童幽门螺旋杆菌感染率无统计学差异(P>0.05)。3月~1岁与1岁~3岁、3岁~6岁与6岁以上组间幽门螺旋杆菌感染率无差异,其余组两两间均有差异。幽门螺旋杆菌感染阴性组儿童的身长/身高与幽门螺旋杆菌感染阳性组间无统计学差异(P>0.05),而幽门螺旋杆菌感染阴性组儿童的体重与幽门螺旋杆菌感染阳性组间有统计学差异(P<0.001);幽门螺旋杆菌感染阳性组与幽门螺旋杆菌感染阴性组中营养不良或矮身材发生率不具有统计学差异(P>0.05)。结果表明,幽门螺旋杆菌的感染在儿童群体中并无性别差异,并未使儿童的身材/身高、以及矮身材、营养不良等严重生长发育性疾病的发病率增加,但可能对儿童的体重带来一定影响。     

用废啤酒酵母制备碱不溶性葡聚糖的研究

研究了用碱法及酶－碱法从啤酒厂排弃的酵母泥中制备碱不溶性葡聚糖的工艺。对NaOH及蛋白酶用量的影响,NaOH作用时间、浓度、作用次数等因素的影响进行了较系统的探讨。先用蛋白酶处理酵母可减少NaOH用量从而减轻环境污染。对多糖产品进行了定性定量分析,得到的产品主要为β（1→3）-D-葡聚糖。     

高压力杀灭大肠杆菌的研究

除传统的加热杀菌及辐照保鲜食品技术外,目前国外正在研究高压力(hydrostatic pressure)食品加工法。食品经此法处理后,可杀死绝大多数细菌,且仍能保持食品新鲜及原味,不会破坏其营养成分。这项技术已被国外列为10大关键科技之一。近来,作者以大肠杆菌为模型,研究了高压力的大小、施压时间及施压时的温度对其存活率的影响。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株:大肠杆菌(Escherichiacoli No.44156)购自上海市卫生防疫站菌种室。 1.1.2 仪器:高压力设备按Paladini和Weber的设计,作者自行研制,可产生1～2500bar压力。 1.1.3 LB培养基(％):胰蛋白胨1,酵母抽提粉0.5,NaCll,pH 7.5,琼脂1.5,121℃20min灭菌