DNA双链断裂的非同源末端连接修复

细胞内普遍存在的DNA双链断裂(DSB)可通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)修复。由于HR仅在存在相同染色体作为模板的时候进行,因此,NHEJ通常为主要的修复方式。在NHEJ中,DSB末端首先由Ku识别,接着由核酸酶、聚合酶在Ku与DNA-PKcs协助下加工,并由连接酶IVXRCC4-XLF连接。NHEJ底物类型多样,末端的修复常包含反复加工的过程,导致修复产物通常无法复原损伤前的序列。虽然无法确保准确修复DNA,NHEJ仍对维持基因组的稳定性具有重要的意义。对NHEJ的研究有助于理解癌症的发生机制并将促进癌症的治疗。     

BRCA1与DSB修复路径取向

乳腺癌易感基因1(BRCA1)是一个肿瘤抑制基因.BRCA1参与DNA末端切除、细胞周期调控以及染色体修饰等来维护基因组的稳定性.有研究表明,它能够促进正确的DNA双链断裂(DSBs)修复,如同源重组修复(HDR)和经典的非同源末端连接(C-NHEJ);而抑制错误性的DSB修复,如单链退火修复(SSA)和非经典的末端连接(A-EJ);其机制是通过与某些DNA修复相关蛋白质的相互作用来引导DSB修复.目前,BRCA1在DSB修复通路中的作用机制尚未完全明确,仍有待进一步的研究.本文主要阐述BRCA1在DSB各修复通路中是如何发挥其引导作用的.     

原核生物的NHEJ修复途径

DNA双链断裂(DSBs)是严重的DNA损伤形式之一,生物体对DSBs的修复可通过同源重组(HR)或非同源末端连接途径(NHEJ)进行。长期以来,人们普遍认为HR是细菌DSBs修复的惟一途径,但在分支杆菌和其它原核生物体内NHEJ途径的发现,使这一观念得以颠覆。最近的研究表明,细菌NHEJ修复系统是一个双组分系统,包含一个多功能的DNA连接酶(LigD)和DNA末端结合蛋白Ku,具有DSBs修复所需的断裂末段识别、末端加工和连接活性。重点综述细菌NHEJ修复系统的组成、结构以及生理功能。     

表观遗传调控：基于染色质环境的DNA双链断裂修复

DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）是威胁基因组完整性和细胞存活的最有害的DNA损伤类型。同源重组（homologous recombination,HR）和非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）是修复DNA双链断裂的两种主要途径。DSB修复涉及到损伤部位修复蛋白的募集和染色质结构的改变。在DNA双链断裂诱导下,染色质结构的动态变化在时间和空间上受到严格调控,进而对DNA双链断裂修复过程进行精细调节。特定的染色质修饰形成利于修复的染色质状态,有助于DNA双链断裂修复机器的招募、修复途径的选择和DNA损伤检查点的活化;其中修复途径的选择对于基因组稳定性至关重要。修复不当或失败可导致基因组不稳定性,甚至促进肿瘤的发生。本文综述了染色质结构和染色质修饰的动态变化在DSB修复中的重要作用。此外,文章还总结了在癌症治疗中靶向关键染色质调控因子在基因组稳定性维持、肿瘤发生发展以及潜在临床应用价值等方面的进展。     

DNA双链断裂修复的选择性调控机制

在各种DNA损伤中,DNA双链断裂(double-strand break,DSB)是最为严重的一种,快速准确地修复DSB对维持基因组稳定性起着至关重要的作用。真核生物细胞通过一系列复杂的信号转导途径激活对DSB的修复,其中最为重要的是同源重组和非同源末端连接机制。最近的研究表明,这两种方式在DSB修复的早期是相互竞争的关系,其选择在很大程度上受到53BP1及同源蛋白质的调控。将讨论53BP1作为DSB修复途径的核心因子,在染色质水平整合BRCA1、Ct IP等修复因子和多种组蛋白修饰构成的信号途径,介导同源重组和非同源末端连接通路选择的分子机制。     

RNA干扰猪NHEJ通路修复因子对HR效率的影响

非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)是动物基因组DNA双链断裂(double-strand break, DSB)修复的优选途径,通过与同源重组(homologous recombination, HR)竞争DSB靶点,进而抑制HR的效率。为提高HR效率,本研究针对猪NHEJ通路修复关键因子PNKP、LIG4和NHEJ1的编码序列,设计并合成相应的靶向小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),组成若干对RNAi (RNA interference)系统,将RNAi系统与报告质粒SSA-GFP reporter、HDR -GFP system和ssODN-GFP system共转染至猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs),检测敲低上述NHEJ关键修复因子后对HR的影响。RNAi结果显示,针对PNKP、LIG4和NHEJ1设计的siRNA均可显著敲低PNKP、LIG4和NHEJ1基因的表达(P<0.05)。选择干扰效果最好的siRNA与报告载体共转染PFFs,结果表明干扰PNKP基因表达后可显著提高单链退火(single strand annealing, SSA)修复效率、双链或单链DNA介导的同源重组定向修复(homology-directed repair, HDR)效率分别为55.7%、37.4%和73.1% (P<0.05),而干扰LIG4和NHEJ1分别提高双链和单链介导的HDR效率为37.5% 和 76.9% (P<0.05)。     

Ku基因在微生物中的研究进展

ku基因介导的非同源末端连接(NHEJ)途径是DNA双链断裂(DSBs)的一种修复机制,它不依赖于同源重组,且通过与之竞争而削弱同源重组。由于ku基因在生物进化过程中的高度保守性,其功能在很多微生物中已经得到研究,尤其在丝状真菌中,将ku基因敲除,在NHEJ途径缺陷的背景下,同源重组发挥主要作用,基因敲除的频率大为提高,从而方便了对基因功能的研究。     

DNA双链断裂修复与重症联合免疫缺陷

DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)是细胞DNA损伤的主要类型,它的修复通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两种机制实现.NHEJ是人和哺乳动物细胞DSBs修复的重要通路,主要由DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)、X射线修复交叉互补蛋白4(XRCC4)、DNA连接酶Ⅳ、Artemis、XLF/Cernunnos和其它DNA损伤修复辅助因子组成.本文重点介绍了NHEJ机制主要成分的特性及其功能,以及这些组分的基因发生突变或缺失所引起的DSBs修复缺陷与辐射敏感性重症联合免疫缺陷(radiosensitive severe combined immunodeficiencies, RS-SCIDs).     

锌指核酸酶技术在植物基因工程中的应用

锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)由3到4个锌指结构(zinc fingers,ZFs)和FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域组成。锌指核酸酶(ZFNs)通过锌指结构(ZFs)与特异核酸位点结合,再利用FokⅠ的酶切作用切割DNA,引起特异位点DNA双链断裂(double strand break,DSB)。DNA双链断裂可以通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ) 或同源重组(homologous recombination,HR)来修复。在修复过程中实现对基因组DNA的靶向修饰。介绍了锌指核酸酶结构、人工构建途径,作用机理和试验步骤,重点综述了锌指核酸酶技术在植物基因工程的应用。     

基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑研究进展

基于CRISPR/Cas的基因编辑是近年发展起来的一项变革性生物技术。其过程包括在目标DNA位点引入双链断裂(double strand break,DSB)以及其后续的细胞修复。细胞修复DSB主要有两种方式：非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)以及同源重组介导的修复(homology-directed repair,HDR)。前者是大多数细胞修复DSB的主要方式,其特点在于修复简单、效率高但极易出错,往往会引发难以预测的核苷酸插入或删除。点突变是自然界中最常见的遗传突变类型,引起了超过半数的人类遗传疾病以及许多重要农艺性状变异。碱基编辑能够实现单个碱基的替换,既不需要引入DSB,又无需修复模板参与,具有高效、编辑结果可控等优点,在基因治疗、作物育种及生物技术研究等方面具有重大的应用潜能。自首个碱基编辑工具开发以来,碱基编辑相关技术得到快速发展及广泛应用。本文综述了目前DNA碱基编辑研究进展,重点阐述了碱基编辑器及其在编辑效率、精度以及特异性提高和编辑范围扩展等方面的最新进展以及仍存在的瓶颈,并展望其研究和应用前景。     

siRNA干扰绵羊胚胎成纤维细胞Lig4基因增加同源重组载体重连修复效率

在动物细胞中,抑制非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)修复途径,可以提高同源重组(Homologous recombination, HR)修复基因组双链断裂(Double-strand brakes, DSBs)的发生概率。为了提高绵羊胚胎成纤维细胞的HR效率,针对NHEJ修复途径中的关键因子Lig4(DNA ligase 4)基因,本文设计合成4个具有靶向性的siRNA(Small interfering RNA)。绵羊胚胎成纤维细胞经电转染导入siRNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting检测,筛选出有效抑制Lig4基因表达的2个siRNA。应用质粒重连法检测HR修复效率,将I-SceⅠ酶线性化的HR质粒和siRNA共转染绵羊胚胎成纤维细胞,经72 h培养及流式细胞仪检测,与对照组细胞比较,结果表明HR质粒重连效率提高了3~4倍。瞬间干扰Lig4基因的表达可提高HR质粒重连效率,为改善绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶效率提供理论基础。     

DNA双链断裂修复途径的选择与调控

DNA双链断裂(double strand break,DSB)是一种导致基因组不稳定性的高毒性损伤,可引起染色质畸变诱发癌症.真核生物中演化出多条保守的DSB损伤修复途径,其中最重要的修复途径是典型的非同源末端连接(clas-sical non-homologous end joining,cNHEJ)和同源重组(h...     

动物基因组定点整合转基因技术研究进展

传统转基因技术,如显微注射、转座子、慢病毒转染等将目的基因插入基因组内的整合方式是随机的,这些随机整合对后期转基因动物品系组建和育种带来诸多不利,因此有研究人员提出了定点整合转基因技术。目前该技术的定点整合效率非常低,主要取决于两个方面：一是靶位点产生DNA双链断裂(double-strand break, DSB)的效率;二是断裂后的靶位点与携带同源臂及外源基因的供体质粒发生同源重组的效率,其中同源重组修复(homologous recombination repair, HDR)是基因组定点整合最为依赖的修复机制。靶位点产生DSB后,机体的DNA修复既可能发生HDR,也可能发生非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ),并且两者之间存在竞争关系,因此激活HDR或抑制NEHJ都可提高定点整合转基因的效率。本文结合影响定点整合的因素,对提高定点整合效率最新探索方面进行了综述。     

BRCA1与DNA损伤修复调控网络

DNA损伤应答机制的存在有助于机体基因组稳定性的维持. BRCA1是一种重要的肿瘤抑制基因,它在DNA损伤应答中发挥了重要的作用. BRCA1可以与BARD1结合形成稳定的异源二聚体,作为BRCA1复合体蛋白组分的核心参与了DNA损伤信号传递、同源重组修复、DNA复制、细胞周期等多途径的调控.本文主要对BRCA1功能及其参与DNA损伤应答网络调控展开阐述,并总结了利用PARP抑制剂针对BRCA1突变肿瘤进行治疗产生耐药性的多种机制.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对DNA双链断裂修复路径的作用

DNA双链断裂(double strand breaks, DSBs)对细胞生存是致命的.细胞内非同源末端连接(NHEJ)、重组修复(HDR)、单链退火修复(SSA)和微同源序列末端连接(MMEJ)等通路可竞争性修复DNA双链断裂损伤.在肿瘤细胞DNA中制造难以修复的基因损伤,诱导肿瘤细胞周期中止、坏死和凋亡是临床放、化疗的主要策略.组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase）作为抗肿瘤治疗的新靶标,其抑制剂(histonedeacetylase inhibitors, HDACi)可显著降低肿瘤细胞DSBs修复能力,增强肿瘤细胞的放、化疗敏感性.研究显示,HDACi抑制了肿瘤细胞中具有正确修复倾向的HDR和经典NHEJ通路,具有错误修复倾向的SSA和MMEJ路径也可能牵涉其中.目前,HDACi作用于DSBs修复通路的分子机制已取得较大进展,但仍有许多问题有待阐明.     

与真核生物DSBs修复有关的NHEJ途径研究进展

DNA双链断裂是真核生物最严重的DNA损伤形式.如果断裂的DNA双链无法及时修复,将可能导致细胞死亡.非同源末端连接途径在真核生物DSBs修复中起重要作用.综述了真核生物NHEJ途径中核心蛋白质Ku、DNA-PKcs、DNA连接酶IV、XRCC4、ARTEMIS和XIF等因子的结构和功能,并简要介绍了NHEJ修复途径的分子机制,其中涉及到DSBs位点蛋白复合体组装的两种模型.     

聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1与DNA双链断裂修复的相关性

DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)是细胞最严重的DNA损伤形式。细胞通过同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径修复DNA双链断裂损伤。聚腺苷二磷酸核糖基化(poly(ADP-ribosyl)ation,PARylation)是蛋白质翻译后修饰过程,这个过程由聚腺苷二磷酸 核糖聚合酶家族(poly(ADP-ribose)polymerases,PARPs)催化完成。PARP1作为PARPs家族最重要的成员,其在DNA损伤应答方面发挥重要作用。研究显示,PARP1在DSBs修复过程中发挥关键作用,参与DSBs的早期应答反应及其具体修复途径,可依据KU蛋白的存在与否发挥不同的特定作用。本文较全面地综述了PARP1在DNA双链断裂修复方面的潜在作用,将为临床疾病的诊治提供新的思路。     

DSBs修复通路的选择及其影响因素

DSBs(DNA双链断裂)是细胞DNA在内外各种因素影响下产生的一种严重损伤,也是包括肿瘤在内的多种疾病发生发展的重要原因之一。为修复该损伤,机体形成了包括同源重组(HR)、非同源末端连接(NHEJ)等在内的多种修复通路;在不同情况下,机体对修复通路的选择受到多种因素的影响。近年来的研究表明,包括细胞类型、末端切除、细胞周期、损伤原因、损伤位置等在内的诸多因素对修复通路的选择均起到了重要的作用。本综述介绍了DSBs修复的常见通路,并对DSBs修复通路的影响因素的最新研究进展进行了综述。     

动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的同源重组效率研究进展*

基因组编辑技术可以对DNA或RNA进行精准改造,极大地促进了生命科学的发展。CRISPR/Cas9系统在靶位点诱导DNA发生双链或单链损伤,细胞对损伤部位采用无供体模板的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或有供体模板的同源重组(homologous recombination,HR)修复。基于HR的基因组编辑策略通常被用于获得DNA的精准改造,而NHEJ在动物DNA损伤修复中起主导作用。为了提升HR效率,研究人员设计了多种方案,包括CRISPR/Cas9系统优化和DNA修复通路调控等。从DNA损伤修复途径、Cas9变体选择、sgRNA设计、供体模板设计、DNA修复途径相关蛋白功能调控、供体模板募集效率提升、细胞周期调控及编辑细胞生存效率提升等方面详细综述了相关研究成果,发现尚未开发出放之四海而皆准的HR提升策略,基于HR的基因组编辑需要针对具体案例制定个体化策略。旨在为动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的HR效率研究提供理论参考,为动物基因功能分析、基因治疗和经济动物基因编辑育种提供帮助。     

基因修饰技术研究进展

基因修饰技术是用于基因组定点改造的分子工具,目前主要有锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)技术和CRISPR-Cas核酸酶(CRISPR-Cas)技术。这些核酸酶都可以在DNA靶位点产生双链断裂(DSB),诱发细胞内源性的修复机制,激活体内非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)两种不同的修复机制,从而实现内源基因的敲除或外源基因的定点敲入。近年来,基因修饰技术已成功应用到细菌、酵母、人类细胞、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、家畜、食蟹猴、拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、小麦和大麦等多种生物,显示了其强大的基因编辑优势。特别是新近出现的CRISPR-Cas9技术,降低了成本,使基因编辑变得简洁、高效和易于操作,得到了很多研究人员的关注。本文系统介绍了以上3种技术的原理及最新研究进展,并对未来的研究和应用做出了展望。