马拉色菌蛋白酶活性测定方法的建立及其应用

为建立检测马拉色菌蛋白酶的方法并检测不同来源菌株的蛋白酶活性 ,使用全脂牛奶平板法、BSA平板法检测 7株标准株 ,3 3株M .furfur、12株M .sympodialis、4株M .obtusa临床分离株和 2 8株M .furfur正常皮肤分离株蛋白酶活性 ,并检测温度、pH值和蛋白酶抑制剂对蛋白酶活性的影响。 7株标准株均检出蛋白酶活性 ,M .furfur临床分离株蛋白酶活性高于正常皮肤分离株 (p <0 .0 1) ,最高蛋白酶活性在 3 2℃、pH5.5时表达 ,EDTA能抑制其蛋白酶活性。全脂牛奶平板法为简便、可靠的测定马拉色菌蛋白酶活性的方法 ,蛋白酶活性与菌株的致病性相关     

一种新的丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶基因的构建、表达与鉴定

根据丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,设计并构建了一种新的单链型丝氨酸蛋白酶分子 .该分子由辅因子NS4A的核心序列、柔性连接子GSGS和NS3丝氨酸蛋白酶结构域组成 .利用设计的 3条引物 ,通过 2轮PCR获得单链丝氨酸蛋白酶基因 ,插入原核表达载体pQE30中 ,转化大肠杆菌M15 ,获得重组克隆 .经低剂量诱导和低温培养 ,目的基因获得高水平可溶表达 .以金属螯合层析法纯化的重组蛋白纯度达 95 %以上 .间接ELISA法检测 98份血清证实 ,该蛋白具有良好的抗原性和特异性 ;以重组蛋白底物NS5ab和单链丝氨酸蛋白酶建立了简便、实用的丝氨酸蛋白酶体外活性检测系统 ;以该系统观察了PMSF和EDTA对蛋白酶活性的影响 .结果表明 ,PMSF能够抑制蛋白酶的酶切活性 ,而EDTA不能抑制酶的活性 .单链型HCV丝氨酸蛋白酶的成功表达以及体外活性检测系统的建立 ,为丝氨酸蛋白酶抑制剂的研制奠定了物质基础 .     

用于植物光系统Ⅱ蛋白酶检测的活性染色方法

采用分离胶中加入0.25%明胶作为底物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对光系统Ⅱ颗粒及其1 mol/L NaCl抽提液中存在的蛋白酶进行了分离、活性检测和部分性质分析.在PSⅡ颗粒的1 mol/L NaCl抽提液中检测到有6条酶带存在,分子质量分别为34、37、50、54、58和68 ku.初步分析了还原剂、离子强度等对蛋白酶活性的影响.此方法分离与检测同步,具有灵敏度高、方便等优点.     

马内菲青霉蛋白酶的体外诱导及其活性测定

目的 建立马内菲青霉蛋白酶的体外诱导方法并进行活性测定。方法 制作酶诱导培养基, 在不同pH 条件下培养马内菲青霉, 在280 nm紫外光下分光光度法检测不同诱导时间的蛋白酶活性。结果 成功诱导并定量测定了马内菲青霉在不同pH条件下、不同诱导时间的体外蛋白酶产出量。pH 4. 0 时, 菌株在第6 天出现分泌高峰; pH 5. 6 时, 菌株在第3 天出现分泌高峰; 而pH 7. 2 时, 菌株几乎无蛋白酶产出。结论 建立了马内菲青霉蛋白酶产出的体外诱导和检测方法, 为进一步研究马内菲青霉体外蛋白酶的理化特性提供了途径。     

凝胶电泳分析蛋白酶活性的技术改进

蛋白酶在植物生长代谢过程中具有重要的生理作用。本文探讨了利用“凝胶电泳技术”分析蛋白酶活性的改进方法,通过改变电泳分离胶中底物蛋白浓度估算了“目标蛋白酶”分子量;通过改变电泳前的样品处理条件了解蛋白酶的部分特性;采用分离胶切割法了解“目标蛋白酶”的最适反应温度范围、最适反应pH范围及蛋白酶的类型等。并对影响凝胶电泳蛋白酶活性检测结果的各种因素作了分析。     

凝胶电泳分析蛋白酶活性的技术改进

蛋白酶在植物生长代谢过程中具有重要的生理作用。本文探讨了利用“凝胶电泳技术”分析蛋白酶活性的改进方法 ,通过改变电泳分离胶中底物蛋白浓度估算了“目标蛋白酶”分子量 ;通过改变电泳前的样品处理条件了解蛋白酶的部分特性 ;采用分离胶切割法了解“目标蛋白酶”的最适反应温度范围、最适反应pH范围及蛋白酶的类型等。并对影响凝胶电泳蛋白酶活性检测结果的各种因素作了分析     

万寿菊根提取物对山楂叶螨谷胱甘肽S-转移酶和蛋白酶及蛋白质含量的影响

采用常规生化实验方法,探讨了山楂叶螨在光、暗条件下经万寿菊根的氯仿提取物(TPC)作用后谷胱甘肽S-转移酶、蛋白酶活性及蛋白质含量. 生物样品采用活体处理和离体处理相结合的方法. 结果表明：万寿菊根氯仿提取物的光活化生物活性最高,其次为水提取物,最后为甲醇提取物;山楂叶螨经TPC处理后,谷胱甘肽S-转移酶和蛋白酶活性显著升高,蛋白质含量明显下降,蛋白酶及蛋白质含量变化程度在光照条件下显著高于黑暗处理.万寿菊根氯仿提取物中存在的活性物质,能够促进山楂叶螨离体酶液中蛋白酶的活化;TPC通过激活试螨体内的蛋白酶而促进蛋白质的降解. 万寿菊次生物质的生物活性主要属于光活化活性.     

鲮鱼皮胶原肽的制备及其抗氧化活性的检测

为了以细菌胞外蛋白酶酶解低值蛋白资源制备抗氧化活性肽以及挖掘新型蛋白酶,采用液体发酵培养的方法对假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.SHK1-2进行发酵产酶,获得胞外蛋白酶粗酶液用于酶解热水法提取的鲮鱼胶原蛋白,通过超滤、sephadex LH-20分子筛层析获得具有DPPH自由基清除能力(35.6%±7%)、氧自由基清除能力(Oxygen radical absorbance capacity,ORAC)及DNA氧化损伤抑制活性的小分子肽,液相色谱质谱联用鉴定该活性肽分子量为776.2 Da,预测氨基酸序列为Thr-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Thr-His。ORAC检测验证了人工合成的多肽同样具有抗氧化活性。研究表明细菌胞外蛋白酶在低值资源高值化中具有一定的应用前景,对于新型蛋白酶及其应用的挖掘具有一定的参考意义。     

Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂IsKuI-1的原核表达、纯化及活性研究

目的:原核表达并制备重组蜱kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂IsKuI-1,检测其抗凝血及抑制蛋白酶活性。方法:构建pET32a-sumo/IsKuI-1原核表达质粒,并转入到E. coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析,在层析柱上用SUMO蛋白酶切割融合伴侣,纯化后得到重组目的多肽rIsKuI-1。用PT及aPTT法检测重组目的多肽的抗凝活性,发色底物法检测rIsKuI-1对丝氨酸蛋白酶的抑制活性。结果:用原核表达系统获得了rIsKuI-1,其无延长PT及aPTT活性,对人中性粒细胞弹性蛋白酶具有较好的抑制活性(IC50=1.83μM),且特异性强。结论:IsKuI-1是一种活性较好的人NE抑制剂。因此为进一步探讨rIsKuI-1的生物学功能及其作为新药开发应用奠定了基础。     

非洲爪蟾孵化酶的纯化及其部分化特性研究

本文以ＧＳＴ－ＶＵＳ．２抗体和卵黄膜为检测手段,采用凝胶过滤和离子交换等方面将非洲爪蟾（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）孵化酶纯化了９０倍以上,并研究了其酶活性和生化特性。实现发现,孵化酶分子量为６０ｋＤ,有很强的蛋白酶活性和卵黄膜溶解活性;它很不稳定,在纯化时极易降解为４０ｋＤ分子,４０ｋＤ分子没有卵黄膜溶解活性,但仍有很强的蛋白酶活性。４０ｋＤ分子中能只代表６０ｋＤ分子中的蛋白酶功能区,而丢失了