利用cDNA - AFLP技术分离棉花抗枯萎病相关基因

目的:分离出棉花抗枯萎病基因片段,并Blast分析其差异片段.方法:以抗枯萎病的棉花品种中棉12号为材料,采用苗期水培方法于三叶期进行枯萎病菌诱导处理,以不接菌为对照.用64对选择性扩增引物对诱导处理和对照的cDNA进行AFLP分析.结果:得到25个阳性差异片段,在GenBank中进行同源性序列比对,24个片段在GenBank数据库中发现同源序列,有1个功能未知.结论:作物的抗病机理复杂,涉及物质和能量代谢,信号传导,逆境响应及蛋白功能调控等方面.     

利用cDNA-AFLP技术分析旱作促进水稻种子根伸长过程中的基因表达

短期旱作促进水稻种子根的伸长。利用cDNA—AFLP技术分析种子根根尖在旱作条件下差异表达的基因,同时比较这些基因在种子根尖、侧根和不定根原基区的表达差异。在1640个片段中,70个在种子根根尖中受旱作诱导,其中24个被克隆并测序。2个基因分别编码丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)和腺嘌吟转磷酸核糖基酶(APRT),并用电子拼接技术获得水稻的APRT全长cDNA;另一个经cDNA末端快速扩增法延长后仍无同源序列。Northern杂交验证了这3个基因的cDNA—AFLP表达谱。这是首次报告使用cDNA—AFLP技术研究水稻根组织的差异表达基因。     

分离差异表达基因的方法

了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况,可以为研究生命活动过程提供重要信息。以差别筛选,扣除杂交等基本方法为出发点,研究基因表达差异的方法不断完善,先后出现了DDRT-PCR,RDA,SSH,cDNA微阵列(基因芯片)等技术。这里着重对这些方法的优缺点及改进进行了论述和评介,并对技术的发展趋势进行了分析。     

贵州梨芽枯间座壳菌属Diaporthe的种类

为明确引起贵州梨芽枯病的间座壳菌种类,本研究进行了病害调查、病芽采集和病菌分离及纯化,根据其菌落特征与ITS序列鉴定,共获得94个间座壳属Diaporthe菌株,从中选取40个代表菌株进行多基因(ITS、TEF、CAL、HIS和TUB)系统发育分析和形态学观察,结果显示它们分属于间座壳属的8个种,包括核桃间座壳菌D. biguttulata、榆树间座壳菌D. eres、椭圆间座壳菌D. ellipsoidea、梭状间座壳菌D. fusicola、香港间座壳菌D. hongkongensis、塞纳间座壳菌D. sennae、大豆间座壳菌D. sojae和蜜柑间座壳菌D. unshiuensis,其中D. ellipsoidea、D. biguttulata和D. sennae为侵染梨的首次报道。玉露香梨离体枝条接种结果显示,8种间座壳的代表菌株均可产生与田间相同的症状,分离比最高的D. eres致病力较强,表明它们均为梨芽枯病的病原菌,其中D. eres为病原优势种。本研究首次报道了引起梨芽枯的间座壳菌种类组成,为该病的发生规律及防控技术研究提供了理论依据。     

cDNA-AFLP比较当归早薹基因转录差异反应体系的建立

建立了利用cDNA-AFLP技术对当归早薹相关的差异表达基因进行筛选的方法,优化了影响cDNA-AFLP试验结果的关键因子,包括选择性扩增模板量、酶离子浓度、dNTP浓度。结果表明,以1μL稀释10倍的预扩增产物作为模板、1.5 mmol/LMgCl2、0.6 mmol/L dNTP,进行的选择性扩增反应获得DNA片段分子量范围较广,在100-1 000 bp长度范围中均有扩增片段,是较为理想的选择性扩增的结果。聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了试验结果,在优化条件下利用部分引物组合可以较好地比较早薹当归在基因转录水平发生的差异。     

进境乌克兰玉米中夹杂向日葵间座壳菌的鉴定

自进境乌克兰玉米中夹杂的向日葵籽上,采用常规平板分离法获得1株疑似向日葵间座壳菌Diaporthe helianthi的菌株76782-5。形态特征观察结果表明,该菌株在PDA上产生分生孢子器和大量β型分生孢子,但未见有性阶段。经rDNA ITS和β-tubulin基因序列比对分析,发现该菌株与GenBank中多个向日葵间座壳菌菌株的基因序列同源性达99%以上,位于同一个发育分支。致病性测定结果表明,该菌株可侵染向日葵根茎部,引起典型茎溃疡病症状。研究结果表明,进境乌克兰玉米中夹杂的向日葵籽上携带有向日葵间座壳菌D. helianthi,这是我国首次截获该种检疫性真菌。     

差异表达基因的分离策略

生命活动的各个进程伴随着不同基因的选择性开启和关闭。如何有效地分离克隆各种差异表达的基因,成为分子生物学研究的一个努力方向,大量差异基因分离策略因之问世。本文扼要介绍了近年来发展的几种主要分离策略,并详细介绍一种新的差异基因分离方法－抑制差减杂交。     

向日葵盐胁迫相关基因的cDNA-AFLP差异表达

目的:研究向日葵盐胁迫前后基因表达的变化,分离并鉴定耐盐相关基因。方法:采用c DNA-AFLP技术分析盐胁迫产生的差异表达基因片段。结果:从256对引物组合中筛选到232对有差异表达的引物组合。用其进行选择性扩增,获得差异表达的上调TDFs 845条。经二次PCR扩增及反向Northern blot验证,获得42个阳性TDFs。对其中12个TDFs进行克隆及序列测定,得到10条TDFs核苷酸序列。经Blastx比对及功能分析,10个TDFs均与应答盐胁迫相关,涉及信号转导相关蛋白、胁迫相关功能蛋白、衰老相关蛋白以及与蛋白相互作用有关的蛋白。结论:利用c DNA-AFLP技术鉴定出一批盐胁迫应答基因,为揭示向日葵耐盐分子机制及指导向日葵耐盐分子育种实践奠定基础。     

差异表达基因的分离策略

生命活动的各个进程伴随着不同基因的选择性开启和关闭。如何有效地分离克隆各种差异表达的基因,成为分子生物学研究的一个努力方向,大量差异基因分离策略因之问世。本文扼要介绍了近年来发展的几种主要分离策略,并详细介绍一种新的差异基因分离方法--抑制差减杂交。     

缘座壳孢菌抑菌活性化合物的分离及鉴定

【目的】座壳孢菌是粉虱和蚧壳虫的一种重要昆虫病原真菌,其代谢产物具有抑菌、杀虫、抗肿瘤和抗氧化等生物活性。本研究旨在分离并鉴定缘座壳孢发酵物中的代谢物,以期为拓展该生防菌的应用提供依据。【方法】基于色谱技术从缘座壳孢菌A. marginata WYTF2017-01发酵培养物中分离化合物,借助波谱手段鉴定其化合物结构,分析化合物的抑菌活性。【结果】本研究共鉴定了12种化合物,包括Methyl 24-methylene-3-oxolanost-8-en-26-oic ester (1)、Ergosta-5,7,22-trien-3-ol,4-methyl-,(3β,4α,22E) (2)、杜斯塔宁(3)、3β-acetoxy-15α,22-dihydroxyhopane (4)、麦角固醇(5)、4-(Hydroxymethyl)-3-furancarboxylic acid (6)、Eupenicisirenin B (7)、4,6-dihydroxy-1(3H)-isobenzofuranone (8)、β-谷甾醇(9)、对叔丁基苯甲酸甲酯(10)、2-benzyl-4H-pyran-4-one(11)和6-benzyl-4-oxo-4H-pyran-3-carboxamide (12),其中化合物1、2、6~12为首次从昆虫病原真菌中分离鉴定。化合物1、2、3、6、7、8、11和12对真菌或细菌具有不同程度的抑制活性,MIC值为3.13~50.00 μg·mL^-1。化合物7、8和12抑菌活性较为突出,化合物7对大肠杆菌的MIC值为3.13 μg·mL^-1,效果与阳性对照链霉素相同,而8和12对青枯劳尔氏菌的MIC值分别为6.25和12.50 μg·mL^-1,优于或等同于链霉素(MIC值为12.50 μg·mL^-1)。【结论】从缘座壳孢菌分离的多种代谢物具有良好的抑菌活性,显示了防治植物病害的潜力。     

Identification of differentially expressed genes in spontaneously regressing melanoma using the MeLiM swine model

Partial and some few cases of complete spontaneous regression have been observed in cutaneous melanoma patients but little is known about the molecular mechanisms involved. The Melanoblastoma-bearing Libechov Minipig (MeLiM) is a suitable animal model to study the phenomenon of spontaneous regression because MeLiM pigs exhibit naturally occurring melanomas which regress completely 6 months after birth. In this study, we used suppression subtractive hybridization (SSH) to identify molecular determinants of melanoma regression within swine melanoma tissues and melanoma cell cultures. Several markers involved in cell-adhesion, -communication, -motility, signal transduction, negative regulation of cell proliferation, transport and immune response were identified that correlated with melanoma regression whereas the main genes involved in melanin synthesis showed a strong downregulation. For the most differentially expressed genes, we validated the results obtained by SSH with qRT-PCR and with immunohistochemistry for some of them (CD9, MITF, RARRES1). Most notable, for the first time in melanoma, we identified the retinoic acid responder 1 gene (RARRES1) as a main actor of the regression process in melanoma. This first gene expression study in swine melanoma regression, may contribute to the finding of new therapeutic targets for human melanoma treatment.