花生ABI3同源基因的定位分析

ABSC ISIC AC ID-INSITIVE3(AB I3)、LEAFY COTYLEDON2(LEC2)和FUSCA3(FUS3)转录因子在种子发育过程中发挥着重要的调控作用。采用Northern杂交技术,用拟南芥AB I3保守的B3结构域部分序列作为探针分别与花生根、茎、叶、子叶RNA进行了杂交,同时也对花生根、茎、叶、子叶(含胚)组织切片进行了原位杂交,结果均显示只有在花生的子叶和胚中有杂交信号出现,表明花生中可能存在AB I3、FUS3和LEC2的同源基因,且它们只分布在花生的子叶和胚中。     

p-CREB在小鼠植入前胚的表达及其与2-细胞阻滞的关系

目的观察p-CREB在小鼠植入前胚以及阻滞品系(昆明小鼠)与非阻滞品系(B6C3F1小鼠)2-细胞胚的分布与表达,初步探讨p-CREB在小鼠植入前胚中的作用以及与小鼠2-细胞阻滞的关系。方法利用激光扫描共聚焦显微镜检测p-CREB在B6C3F1小鼠植入前胚中的定位,比较不同品系小鼠体外培养以及B6C3F1小鼠体外培养与体内发育2-细胞胚内p-CREB的表达变化。结果 p-CREB的免疫阳性反应在小鼠1-细胞胚中主要分布于细胞质中;2-细胞胚及其后期植入前胚主要定位于细胞核内;昆明小鼠体外培养2-细胞胚核内荧光强度显著低于同一条件发育的B6C3F1小鼠,B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚核内荧光强度显著高于体内发育。结论 p-CREB在小鼠植入前胚发育中起重要作用,p-CREB在昆明小鼠2-细胞胚核内表达较低可能与小鼠2-细胞阻滞有关。     

多能性转录因子OCT4和SOX2在体外发育的小鼠2-细胞胚胎的表达与定位

为探讨多能性转录因子OCT4和SOX2在昆明小鼠(Mus musculus)2-细胞胚胎发育过程中与2-细胞胚胎阻滞发生的相关性,本研究应用实时荧光定量PCR技术检测了小鼠卵母细胞及在M16培养液中培养的不同发育阶段体外受精胚Oct4和Sox2基因的表达,并利用实时荧光定量PCR和免疫荧光技术比较了2-细胞胚、2-细胞阻滞胚和4-细胞胚的OCT4和SOX2的表达与定位。采用ANOVA对实验所得的数据进行分析,P0.05被认为是具有显著性差异。研究结果显示,2-细胞胚只有24.8%发育成4-细胞胚,75.2%的2-细胞胚发生了阻滞。Sox2和Oct4的m RNA在MⅡ期卵母细胞、原核胚、2-细胞胚、4-细胞胚、桑椹胚和囊胚中都有表达。Oct4 m RNA的表达水平在4-细胞胚显著高于2-细胞胚和2-细胞阻滞胚(P0.05),Sox2 m RNA的表达水平在2-细胞胚显著高于2-细胞阻滞胚和4-细胞胚(P0.05),而后两者之间没有差异(P0.05)。OCT4蛋白在2-细胞胚和4-细胞胚中与核共定位,但在2-细胞阻滞胚中弥散存在于胞质中。SOX2蛋白在以上3类胚胎中始终定位于细胞核。上述结果提示,转录因子OCT4和SOX2的表达和定位与小鼠2-细胞胚胎发育阻滞相关,母源性SOX2表达的维持对胚胎合子基因组激活(ZGA)的发生具有重要作用,母源性OCT4的异常定位可能影响了合子基因组激活相关基因的激活,而合子中Oct4的表达影响合子基因组激活后胚胎的发育。     

鹅细小病毒和番鸭细小病毒核酸疫苗重组质粒的构建及表达

将鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MPV）主要结构蛋白（VP2－VP3）基因克隆到核酸疫苗质粒pIRESlneo载体上,构建了核酸疫苗重组质粒pIGVP1和pIMVP,通过脂质体转染法分别将重组质粒到鹅胚成纤维细胞和番鸭胚成纤维细胞中,核酸疫苗重组质粒pIGVP1和pIMVP分别转染鹅胚成纤维细胞和番鸭成纤维细胞中,于转染后72h收取细胞,细胞裂解液裂解后,经Western blot检测其表达产物可出现特异性反应带,证明表达产物具有很好的反应原性。     

糖、GA3及ABA对印度娃儿藤(Tylophora indica(Burm.f.)Merrill)体细胞胚发生的影响

从印度娃儿藤节间外植体获取愈伤组织,分析了糖、赤霉素(GA3)及脱落酸(ABA)对愈伤组织形成体细胞的影响。实验证明,含4μmol/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的MS培养基是获得具有成胚功能的愈伤组织的最佳培养基。在含有6μmol/L激动素(Kn)的MS培养基上,高达69%的愈伤组织分化为体细胞胚,平均单位外植体(每克愈伤组织)产胚25个。在6μmol/LKn存在的条件下,分析了蔗糖、葡糖糖对胚产生的影响,不同的糖及不同糖浓度对体细胞胚的发生影响很大。6μmol/L Kn与200mmol/L蔗糖处理胚胎发生率最大(71%),单位外植体生成49个胚。然而葡萄糖与Kn、或者葡糖糖、蔗糖与Kn三者加在一起则降低成胚率及产胚数。一定浓度的GA3和ABA能促进体细胞胚的产生。在含200mmol/L蔗糖的培养基中加10μmol/LGA3胚的生成率为98%,单位外植体产胚51个。在含200mmol/L蔗糖的培养基中加2μmol/L ABA能显著增加体细胞胚的量,该培养基上每外植体平均生成44个胚,产率为95%。本研究显示,含200mmol/L蔗糖的培养基中分别加入6μmol/L Kn、10μmol/L GA3或者2μmol/L ABA能显著提高印度娃儿藤体细胞胚发生率,而单独的葡萄糖或葡糖糖和蔗糖则有抑制作用。得到的胚均能正常发育并分化为植株。     

糖、GA3及ABA对印度娃儿藤（Tylophora indica (Burm. F.) Merrill）体细胞胚发生的影响

从印度娃儿藤节间外植体获取愈伤组织,分析了糖、赤霉素（GA₃）及脱落酸（ABA）对愈伤组织形成体细胞的影响。实验证明,含4 μmol/L 2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D）的MS培养基是获得具有成胚功能的愈伤组织的最佳培养基。在含有6 μmol/L激动素（Kn）的MS培养基上,高达69%的愈伤组织分化为体细胞胚,平均单位外植体（每克愈伤组织）产胚25个。在6 μmol/L Kn存在的条件下,分析了蔗糖、葡糖糖对胚产生的影响,不同的糖及不同糖浓度对体细胞胚的发生影响很大。6 μmol/L Kn 与200 mmol/L 蔗糖处理胚胎发生率最大（71%）,单位外植体生成49个胚。然而葡萄糖与Kn、或者葡糖糖、蔗糖与Kn三者加在一起则降低成胚率及产胚数。一定浓度的GA₃ 和 ABA能促进体细胞胚的产生。在含200 mmol/L蔗糖的培养基中加10 μmol/L GA₃胚的生成率为98%,单位外植体产胚51个。在含200 mmol/L蔗糖的培养基中加2 μmol/L ABA能显著增加体细胞胚的量,该培养基上每外植体平均生成44个胚,产率为95％。本研究显示,含200 mmol/L蔗糖的培养基中分别加入6 μmol/L Kn、10 μmol/L GA₃ 或者 2 μmol/L ABA能显著提高印度娃儿藤体细胞胚发生率,而单独的葡萄糖或葡糖糖和蔗糖则有抑制作用。得到的胚均能正常发育并分化为植株。     

玉米胚发育过程中内源ABA和GA3的含量变化及其与脱水耐性形成的关系

以发育的玉米肌为材料。用酶联免疫吸附检测技术测定了玉米胚发育和脱水过程中内源ABA和GA2含量的动态变化,以及它们与胚的脱水耐性形成的关系。结果表明．玉米胚在发育过程中其ABA含量峰值出现在GA2含量峰值之前,而且ABA峰值出现在授粉后28d,晚于胚的含水量下降;胚在脱水过程中ABA和GA2的含量都呈先上升后下降的变化。可以认为在脱水过程中ABA含量的增加是胚对脱水胁迫应激反应的结果．有保护胚的作用;但GA2含量增加的生理机制及其作用尚不清楚。在玉米胚的发育过程中．内源ABA和GA3之间的相对平衡可能主要调控胚的发育进程和萌发力的形成;胚的ABA含量变化可能不足以引起其脱水耐性的形成。     

经野生稻总DNA处理的栽培稻离体胚长成植株后的某些性状变化(简报)

栽培稻离体胚（幼胚、萌动胚）以野生稻总ＤＮＡ浸泡或滴加处理后,经组织培养长成的完整植株进行盆栽的结果显示,当代与后代植株中大多数无变异,仅１株产生芒,２株抗稻瘟病。有芒种子再次种植于人工气候室内,其Ｄ_１、Ｄ_２和Ｄ_３代种子仍有芒;抗稻瘟病植株的种子收获后再次播种,后代仍有抗稻瘟病特性。     

枸杞体细胞胚发生过程中Ag~ 对痕量金属离子吸收的影响

以药用植物宁夏枸杞愈伤组织为材料,离体培养诱导体细胞胚发生。采用多重示踪剂和γ射线能谱分析法研究不同浓度AgNO_3处理的枸杞体细胞胚发生过程中对多种痕量金属元素离子的吸收。结果表明:(1)当AgNO_3的浓度小于50mg/L时,随着AgNO_3浓度的增加,多种痕量金属离子的吸收率也随之增加,而超过此浓度后,对多种痕量金属离子的吸收影响不同。Ag~ 对痕量金属离子的吸收有协同,拮抗或竞争的作用。(2)适当浓度的AgNO_3对细胞分化及体细胞胚发生有促进作用。当AgNO_3的浓度小于50mg/L时,随着AgNO_3浓度的增加,体细胞胚的发生频率随之增加。Ag~ 对枸杞体细胞胚发生表现促进作用,当AgNO_3的浓度为50mg/L时,可大大提高愈伤组织中体细胞胚发生,是对照(不加AgNO_3)组的3倍左右。而超过此浓度后,Ag~ 对枸杞体细胞胚发生表现毒害作用,体细胞胚的发生受到明显抑制。     

经野生稻总DNA处理的栽培稻离体胚长成植株后的某些性状变？…

栽培稻离体胚（幼胚、萌动胚）以野生稻总ＤＮＡ浸泡或滴加处理后,经组织培养长成的完整植株进行盆栽的结果显示,当代与后代植株中大多数无变异,仅１株产生芒,２株抗稻瘟病,有芒种子再次种植于人工气候室内,其Ｄ１、Ｄ２和Ｄ３代种子仍有芒;抗稻瘟病植株的种子收获后再次播种,后代仍有抗稻瘟病特性。     

AgNO3对橡胶树花药愈伤组织形态及体胚发生的影响

橡胶树的花药愈伤组织在长期继代过程中,胚性易下降甚至丧失;而AgNO3作为乙烯活性抑制剂,被广泛应用于植物组织培养中.该研究以继代培养4 a以上的热研7-33-97花药愈伤组织为材料,在继代培养基中添加2.5 mg·L-1 AgNO3预培养35 d后,观察预培养前后愈伤组织表形及其细胞形态的变化,并设计不同浓度AgNO3及不同处理时间对其进行体胚诱导,90 d后分别统计胚状体总数和正常胚数.结果表明:浅黄色质地柔软的愈伤组织在含AgNO3的培养基上预培养后能转变成鲜黄色易碎愈伤组织,在倒置显微镜下前者大多表现为不规则多边形,细胞内含物较稀薄;而后者则呈圆形或椭圆形,细胞内含物丰富,属于典型的胚性细胞.在体胚诱导的第1个月添加5 mg·L-1 AgNO3能显著促进体胚的发生,AgNO3浓度升至10 mg·L-1时体胚发生受到抑制,且畸形胚的形成率显著增加;在含5 mg·L-1 AgNO3的培养基中培养2个月以上,体胚发育明显受阻,大部分形成畸形胚.该研究结果在一定程度上恢复了橡胶树长期继代花药愈伤组织的胚性能力,并提高了其体胚发生频率,为橡胶树花药胚性愈伤组织长期继代培养过程中胚性的保持提供了参考.     

1个新巨胚等位基因的鉴定与表达分析及其性状考察

该研究以‘超2-10’水稻和‘上师大5号’巨胚水稻为材料,分析了2种水稻的胚重、胚与糙米质量比、巨胚性状的遗传,克隆和分析了其巨胚基因(GE)序列,并对巨胚基因进行了表达分析。结果显示:(1)‘上师大5号’的胚重、胚与糙米质量比均极显著大于‘超2-10’,且‘超2-10’的胚重接近或大于一些已报道的巨胚水稻;(2)‘上师大5号’巨胚表型由1对隐性基因控制,并与韩国巨胚稻‘M-2-565-11-3-B(ge)’属于相同的等位基因突变;(3)‘超2-10’、‘上师大5号’和‘M-2-565-11-3-B(ge)’3种水稻各自具有1个新的GE等位基因,它们的突变位点分别位于启动子、启动子及编码链、编码链;(4)‘上师大5号’启动子及编码链都有突变的GE等位基因(gec),在开花后4~7d的颖果中表达量持续增加,完全不同于只有编码链突变的GE等位基因呈持续下降的表达模式。该研究首次报道了突变在启动子、突变同时发生在启动子及编码链2种新型巨胚等位基因。     

麦类作物多胚的研究 Ⅰ.麦类作物多胚的自然发生

用青海高原自然条件下种植的小麦不同种、杂种、幼胚培养后代,大麦、黑麦和小黑麦的种子作发芽试验,从普通小麦及其杂种、幼胚离体培养后代和大麦中,出现了多胚苗。５９个小麦品种中只有高原６０２及２９０个普通小麦品种间杂种吸８个、１８个幼胚培养后代中有２个出现了双胚苗,出现频率虽低,但能遗传。     

细胞周期蛋白D3在兔妊娠早期子宫和胚胎中的表达与调节

利用免疫组织化学及RT—PCR的方法,研究了细胞周期蛋白D3(Cyclin D3)在兔早期妊娠子宫和着床前胚胎中的表达情况,以揭示CyclinD3在兔胚胎着床过程中的可能作用。结果显示：(1)在兔妊娠第3～8天的子宫近肌层的腺上皮中有CyclinD3免疫染色,并且其表达强度在第7天以后呈现下降的趋势,着床的胚胎中未见CyclinD3免疫染色;(2)在第2～5天的假孕兔子宫的腺上皮中有较强的CyclinD3免疫染色;(3)在发情周期的兔子宫中未见其有表达;(4)在切除卵巢的兔中,注射雌激素后子宫中未见CyclinD3免疫染色,注射孕酮后在子宫腺上皮中有CyclinD3免疫染色,在孕酮和雌激素共同处理后的子宫腺上皮中有较强的CyclinD3免疫染色;(5)利用RT—PCR的方法在早期胚胎中均能检测到CyclinD3,但从胚泡期开始表达上升,到扩展胚泡时其表达最强。上述结果表明,CyclinD3的表达可能对兔胚泡的着床具有一定的调节作用。     

质谱检测叶酸缺乏人胚肾细胞中低组蛋白H3赖氨酸79甲基化修饰

目的:探讨叶酸(Folic acid,FA)缺乏在培养的人胚肾细胞(HEK-293)中对细胞组蛋白修饰水平的影响。方法:人胚肾细胞分两组培养,一组正常培养,一组无叶酸培养。细胞提取组蛋白后通过高效液相色谱一线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-LTQ/Orbitrap Ms)检测组蛋白的修饰以比较叶酸缺乏对人胚肾细胞组蛋白修饰的影响。结果:用高分辨质谱方法成功检测到人胚肾细胞的五个组蛋白变体H1,H3,H4,H2a和H2b上的33个组蛋白修饰位点,其中23个修饰位点为uniprot数据库上已经报道的组蛋白修饰位点,而其余10个为未报道修饰位点。通过质谱比较正常和叶酸缺乏组人胚肾细胞修饰谱发现H3K79me1和H3K79me2在叶酸缺乏培养组中检出率较低。进一步用蛋白免疫印迹的方法也证明了在叶酸缺乏的人胚肾细胞中H3K79me1水平低于正常培养组。结论:细胞中叶酸缺乏影响组蛋白甲基化包括H3K79me2和H3K79me1修饰水平,提示细胞外营养因素叶酸水平可影响组蛋白修饰水平从而参与疾病如神经管畸形(Neural tube defect,NTD)的发生。     

质谱检测叶酸缺乏人胚肾细胞中低组蛋白H3赖氨酸79甲基化修饰

目的：探讨叶酸（Folic acid,FA）缺乏在培养的人胚肾细胞（HEK-293）中对细胞组蛋白修饰水平的影响。方法：人胚肾细胞分两组培养,一组正常培养,一组无叶酸培养。细胞提取组蛋白后通过高效液相色谱一线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC-LTQ/Orbitrap Ms）检测组蛋白的修饰以比较叶酸缺乏对人胚肾细胞组蛋白修饰的影响。结果：用高分辨质谱方法成功检测到人胚肾细胞的五个组蛋白变体H1,H3,H4,H2a和H2b上的33个组蛋白修饰位点,其中23个修饰位点为uniprot数据库上已经报道的组蛋白修饰位点,而其余10个为未报道修饰位点。通过质谱比较正常和叶酸缺乏组人胚肾细胞修饰谱发现H3K79me1和H3K79me2在叶酸缺乏培养组中检出率较低。进一步用蛋白免疫印迹的方法也证明了在叶酸缺乏的人胚肾细胞中H3K79me1水平低于正常培养组。结论：细胞中叶酸缺乏影响组蛋白甲基化包括H3K79me2和H3K79me1修饰水平,提示细胞外营养因素叶酸水平可影响组蛋白修饰水平从而参与疾病如神经管畸形（Neural tube defect,NTD）的发生。     

幼胚长度、2，4-D浓度、光强度等对花生体细胞胚发生的影响及高效再生系统的建立

花生幼胚在含2,4-D的诱导培养基中,形成近球状的致密的胚性愈伤组织、杆状两极结构及子叶期体胚。继代培养也有体胚发生。光照明显抑制体胚发生类似于自然栽培的情况。成熟培养基中诱导体胚根、芽两极发育完全。光下,具有根、芽的体胚于再生培养基中长成小植株后移栽于盛沙土的盆中正常生长、结实。在较好的影响因素(光照、幼胚长度、激素、切分方式、接种密度)组合下,体胚发生频率达75％以上,每子叶形成体胚3个以上。该体细胞胚高效再生系统与合子胚的发育相似,是遗传转化和胚发育研究的良好系统。     

雌激素受体α抑制剂MPP对小鼠合子型基因组激活的影响可能与S期启动相关

目的观察雌激素受体α(ERα)特异性抑制剂甲基哌啶吡唑(Methyl-Piperidino-Pyrazole,MPP)对小鼠早期胚胎发育的影响与合子型基因组激活(ZGA)发生的时间是否相关,并检测与小鼠ZGA密切相关的2-细胞胚DNA复制是否受MPP处理的影响,为进一步探讨ERα在小鼠ZGA过程中的作用机制提供实验基础。方法 1收集昆明小鼠1-细胞胚、2-细胞胚和4-细胞胚,以空白KSOM培养液(单纯型优化的胚胎培养基)为对照组,以KSOM中添加MPP为实验组;将各时间点收集的早胚培养3h后再移入新KSOM培养液中继续培养至囊胚阶段,并记录囊胚数;2收集昆明小鼠末期1-细胞胚,分别置于上述两组培养液中培养15h至2-细胞胚S期后期,用荧光显微镜技术检测2-细胞胚核像变化;Brd U标记法分析DNA复制情况。结果1于不同时间段经MPP 3h处理后,在1-细胞胚末期、2-细胞早期和2-细胞胚中后期,MPP处理对小鼠早胚发育具有显著的抑制作用,其阶段特异性影响与小鼠ZGA发生的时间一致。另外,MPP对2-细胞胚G1/S过渡期(36~39h)抑制明显,但是对S期中后期(39~42h)进程无显著影响。2与KSOM组相比,经MPP处理15h后,2-细胞胚核变圆;Brd U标记水平明显下降。结论MPP在小鼠早胚中的阶段性作用与ZGA有关;ERα可能通过促进S期启动来调控ZGA。     

枸杞体细胞胚发生中Ca2+和ATPase的超微结构定位研究

研究2,4-D诱导枸杞体细胞胚发生中的作用及其与Ca~(2+)含量和ATPase活性时空分布动态之间的关系,以探讨2,4-D诱导植物体细胞胚发生的作用机理。采用超微细胞化学定位的方法,跟踪分析了体细胞胚发生与发育的不同时期,Ca~(2+)和ATPase活性的时空分布动态。结果表明:2,4-D是诱导离体培养的枸杞体细胞进入胚胎状态的关键激素。在含有2,4-D和不含2,4-D的培养条件下,分别诱导枸杞体细胞脱分化后,再转入除去2,4-D的MS培养基上,进行分化培养,结果前者可分化形成体细胞胚,因而称为胚性愈伤组织。后者在相同条件却不能分化形成胚,故称为非胚性愈伤组织。在2,4-D诱导枸杞的胚性愈伤组织中,胚性细胞分化早期的细胞间隙和细胞壁上均有Ca~(2+)沉淀。随着胚性细胞的分化、分裂和多细胞原胚形成,这时Ca~(2+)在细胞内的分布主要集中在细胞膜和液泡膜上;球形胚期在细胞核中Ca~(2+)呈弥散性分布。在此过程中,ATPase活性时空分布与Ca~(2+)的定位变化具有高度一致性,仅仅稍滞后于Ca~(2+)出现的时间。而在胚性细胞分化早期,ATPase活性同样位于质膜上,随后在液泡和细胞核都可见ATPase活性分布。而在非胚性愈伤组织中,则未见Ca~(2+)和ATPase活性呈时空动态分布,而且随着非胚性细胞的液泡化,无论是Ca~(2+)含量,还是ATPase活性都呈逐渐降低的趋势。表明Ca~(2+)和ATPase活性变化与2,4-D诱导的胚性细胞分化和发育密切相关。并由此推测,Ca~(2+)和ATPase的时空分布对胚性细胞分化中的信息传递和调控相关基因表达起着关键性作用。     

枸杞体细胞胚发生中Ca^2＋和ATPase的超微结构定位研究

研究2,4-D诱导枸杞体细胞胚发生中的作用及其与Ca^2 含量和ATPase活性时空分布动态之间的关系,以探讨2,4-D诱导植物体细胞胚发生的作用机理。采用超微细胞化学定位的方法,跟踪分析了体细胞胚发生与发育的不同时期,Ca^2 和ATPase活性的时空分布动态。结果表明：2,4-D是诱导离体培养的枸杞体细胞进入胚胎状态的关键激素。在含有2,4-D和不含2,4-D的培养条件下,分别诱导枸杞体细胞脱分化后,再转入除去2,4-D的MS培养基上,进行分化培养,结果前者可分化形成体细胞胚,因而称为胚性愈伤组织。后者在相同条件却不能分化形成胚,故称为非胚性愈伤组织。在2,4-D诱导枸杞的胚性愈伤组织中,胚性细胞分化早期的细胞间隙和细胞壁上均有Ca^2 沉淀。随着胚性细胞的分化、分裂和多细胞原胚形成,这时Ca^2 在细胞内的分布主要集中在细胞膜和液泡膜上;球形胚期在细胞核中Ca^2 呈弥散性分布。在此过程中,ATPase活性时空分布与Ca^2 的定位变化具有高度一致性,仅仅稍滞后于Ca^2 出现的时间。而在胚性细胞分化早期,ATPase活性同样位于质膜上,随后在液泡和细胞核都可见ATPase活性分布。而在非胚性愈伤组织中,则未见Ca^2 和ATPase活性呈时空动态分布,而且随着非胚性细胞的液泡化,无论是Ca^2 含量,还是ATPase活性都呈逐渐降低的趋势。表明Ca^2 和ATPase活性变化与2,4-D诱导的胚性细胞分化和发育密切相关。并由此推测,Ca^2 和ATPase的时空分布对胚性细胞分化中的信息传递和调控相关基因表达起着关键性作用。