黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究

研究黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性,采用酶学研究方法,通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100纯化了β-葡萄糖苷酶,并进行了黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最适反应温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及米氏常数等特性研究,采用SDS-PAGE凝胶电泳测定了分子量。研究表明,β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃、最适反应pH为4.5;在40、50和60℃下较稳定,80℃以上稳定性差;β-葡萄糖苷酶在pH为3、7、8、9的缓冲液中的稳定性很差,在pH为4、5、6的缓冲液中稳定性较好,其中在pH为5时,稳定性最好;酶的Km=41.67 mmol/L,Vmax=23.81 U/L;其分子量为65.2 ku。β-葡萄糖苷酶在饲料工业具有良好的应用前景。     

黑曲霉固态发酵制备β-葡萄糖苷酶发酵条件优化

对一株黑曲霉菌固态发酵产β-葡萄糖苷酶的产酶条件进行了优化.通过单因素实验考察了不同碳源、氮源、固液比、诱导剂及产酶时间等6 种因素对产β-葡萄糖苷酶的影响.在单因素的基础上,进行了五因素四水平正交实验.结果表明,在培养基组分中秸秆与麦麸的比例为3:3,固液比为1:3,氮源为3% 硝酸铵,发酵时间为5d,采用CMCNa 作为诱导剂时得到的β-葡萄糖苷酶活力最高,可达40.06 U/g.     

固定化黑曲霉β-葡萄糖苷酶制备染料木素活性苷元的研究

比较了以海藻酸钠为载体,用胶囊法、包埋-交联法、交联-包埋法三种不同方法固定化黑曲霉β-葡萄糖苷酶的效果,并研究了最佳固定化方法的固定化条件和固定化酶的部分性质。结果表明,交联-包埋法即β-葡萄糖苷酶与0.20%戊二醛交联后再用2.0%海藻酸钠包埋的固定化方法中酶结合效率和酶活力回收率最高。海藻酸钠浓度和戊二醛浓度对酶结合效率影响较大,戊二醛浓度和包埋颗粒直径大小对酶活力回收率影响显著。与游离酶相比,制备的固定化酶最适温度、最适pH值和Km值分别由50℃、4.5和2.57μg/mL下降到40℃、4.0和2.02μg/mL。固定化酶具有更强的耐酸性和稳定性。该固定化酶用于大豆异黄酮活性苷元染料木素的合成,重复使用6次后,固定化酶的活力仍保持84.94%,染料木苷转化率为56.04%。     

固定化黑曲霉β-葡萄糖苷酶制备染料木素活性苷元的研究

比较了以海藻酸钠为载体,用胶囊法、包埋-交联法、交联-包埋法三种不同方法固定化黑曲霉β-葡萄糖苷酶的效果,并研究了最佳固定化方法的固定化条件和固定化酶的部分性质。结果表明,交联-包埋法即β-葡萄糖苷酶与0.20%戊二醛交联后再用2.0%海藻酸钠包埋的固定化方法中酶结合效率和酶活力回收率最高。海藻酸钠浓度和戊二醛浓度对酶结合效率影响较大,戊二醛浓度和包埋颗粒直径大小对酶活力回收率影响显著。与游离酶相比,制备的固定化酶最适温度、最适pH值和K_m值分别由50℃、4.5和2.57 μg/mL下降到40℃、4.0和2.02 μg/mL。固定化酶具有更强的耐酸性和稳定性。该固定化酶用于大豆异黄酮活性苷元染料木素的合成,重复使用6次后,固定化酶的活力仍保持84.94%,染料木苷转化率为56.04%。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的催化性质

通过测定黑曲霉β-葡萄糖苷酶的底物特异性,表明该酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯-β-D葡萄糖苷,还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖苷和β-D-木糖苷。Ag~+、Cu~(2+)和Hg~(2+)对该酶有较强的抑制作用。该酶水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷、水杨苷和纤维二糖的Km值分别为2.32、19.11和30.18mmol/L,V_(max)则分别为412、237和198μmol·min~(-1)·mg~(-1),Lineweaver-Burk作图法表明,D-葡萄糖和δ-葡萄糖酸内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为5.17和1.31mmol/L。     

黑曲霉生产β-葡萄糖苷酶发酵条件的研究产

经多项式回归分析,研究了不同浓度Ｎ 源、Ｃ 源、无机盐等对酶产量的影响,确定出最佳培养基配方为：麸皮４ ．９ ％ ,（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０ ．４ ％ ,ＫＨ２ＰＯ４ ０ ．２９ ％ ,ＣａＣｌ２ ０ ．０５ ％ ,ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０ ．０４ ％ ,ＦｅＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ５ｍｇ·Ｌ－ １ ,ＺｎＣｌ２ １ ．４ｍｇ·Ｌ－ １ ,０ ．２ ％ 油酸钠．并对培养温度、时间、培养基初始ｐＨ、通气量、接种量、接种方式等培养条件进行优化,使黑曲霉生产β葡萄糖苷酶的产量由１７Ｕ·ｍｌ－ １ 增至２１ ．３Ｕ·ｍｌ－ １ ．     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的提纯与性质

从黑曲霉Aspergillus niger,发酵液中分离提纯了β-葡萄糖苷酶。提纯步骤通过(NH₄)₂SO₄分级沉淀,DEAE-Sephadex A-50和Sephadex G-100等三步纯化,得到凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。该酶的最适pH4.5,最适温度60℃,Km为0.44(pNPG),并有较好的热稳定性。用SDS-凝胶电泳法和凝胶色谱法测得该酶的分子量为120 000。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶产酶条件的优化

本研究对AspergillusnigerGlu05生产β-葡萄糖苷酶的培养基组分及培养条件进行了优化。优化后的培养基组成和培养条件分别为：麸皮4％,tryptone4％,1gmolMnSO4,1／zmolNaCl,KH2PO40．2％,pH自然,摇床转速250r／r/min,培养温度30℃,培养周期5d。优化后发酵液中酶活力达到44．11IU／mL,与初始的产酶水平32．87IU／mL相比,提高了36％。     

海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的研究

以海藻酸钠为载体,研究了β-葡萄糖苷酶固定方法及其条件,并利用固定化β-葡萄糖苷酶进行了酶解试验。结果表明,采用交联-包埋方式,在海藻酸钠质量分数3．5％、给酶量100U／g载体、戊二醛体积分数1％、氯化钙质量分数2％的条件下固定β-葡萄糖苷酶2h,可以获得较佳的固定化效果。其固定率达到65％,重复分批利用20次仍能保持90％以上的酶解得率。利用固定化β-葡萄糖苷酶连续酶解纤维二糖时,在不同进料速度下有着不同的催化效率,当进料速度为1．5mL／min、1．0mL／min时,酶解得率分别达到96,7％和99．0％;与木霉纤维素酶协同水解纤维素时,在β-葡萄糖苷酶总酶活与滤纸酶活之比为0．5（FPA为2．0U／mL）的条件下,酶解滤纸纤维素和微晶纤维素60h的得率比单独采用木霉纤维素酶分别增加了20．4％和29．3％。研究结果对于解决酶法水解纤维资源得率低、酶使用成本高这一关键问题提供了一种有效的方法。     

固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天甙的研究

目的:利用海藻酸钠和壳聚糖固定β-葡萄糖苷酶,催化合成红景天甙,并对固定化条件的选择、固定化酶催化合成红景天甙的条件优化进行研究.方法:采用正交实验方法寻求最佳固定化条件,以转化率为指标对合成条件进行优化.结果:固定β-葡萄糖苷酶的最佳条件为:壳聚糖浓度1.5%,吸附时间9h,交联时间12h,戊二醛浓度1.0%,吸附温度O℃,酶活力回收率达74.38%.催化合成红景天甙的最佳条件为:反应介质pH 5.8醋酸缓冲液/叔丁醇(1:9),底物浓度酩醇5g/L,D-葡萄糖与酪醇摩尔比为1:1,反应时间50h,反应温度50℃,红景天甙的转化率最高可达到71.9%.结论:固定化酶催化合成红景天甙的转化率得到较大的提高,为工业化生产提供了可靠的理论依据.     

黑曲霉与里氏木霉固态混合发酵产β-葡萄糖苷酶

对黑曲霉NL02与里氏木霉RUT-C30固态混合发酵产β-葡萄糖苷酶的发酵培养基进行优化,研究培养基含水率、C源、N源、接种量、温度和2种菌种不同延长接种时间与接种比例对β-葡萄糖苷酶活力的影响。研究表明：麸皮17.5 g、玉米芯7.5 g、（NH4）2SO4 0.40 g、尿素0.37 g、黑曲霉孢子接入量为107个接种到250 mL三角瓶中,温度30 ℃、摇床转速100 r/min时,里氏木霉以105个孢子与黑曲霉同时接入,每克干曲所得β-葡萄糖苷酶的活力为132.45 IU,较黑曲霉单独培养时的104.35 IU提高了26.94%。     

交联壳聚糖微球固定化β-葡萄糖苷酶工艺研究

目的:以戊二醛交联壳聚糖微球为载体,通过共价连接反应固定化β-葡萄糖苷酶.方法:以固定化酶比活和酶活回收率为目标,采用单因素方法优化固定化工艺、微球制备条件.结果:微球最佳制备条件:2.5%壳聚糖,2%乙酸,7.5%氢氧化钠,氢氧化钠:乙醇(v/v)=1:1.最佳固定化工艺为:0.1g壳聚糖微球在20mL 3%戊二醛溶液中50℃交联2h.加酶量为7 388mU/g干球,25℃吸附24h.固定化酶比活为6 188mU/g干球,酶活回收率为95.4%.结论:交联壳聚糖微球共价连接法可有效固定化β-葡萄糖苷酶.     

利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶催化香兰素葡萄糖苷水解

本文通过在香兰素葡萄糖苷溶液中加入黑曲霉菌种发酵制取的β-葡萄糖苷酶,进行酶促反应实验,定时取样进行高效液相分析检测,结果表明在反应过程中,溶液中香兰素葡萄糖苷的含量呈逐步下降趋势,香兰素的量呈逐步增加趋势;而在没有加β-葡萄糖苷酶的对照实验中,整个反应过程中香兰素葡萄糖苷的含量基本没有出现什么变化,在反应液中也没有检测到香兰素,这说明黑曲霉β-葡萄糖苷酶能够催化香兰素葡萄糖苷分解为香兰素的反应.     

响应面法优化黑曲霉HDF05产β-葡萄糖苷酶过程参数

为获得黑曲霉Aspergillus niger HDF05菌株较高的β-葡萄糖苷酶酶活,对其发酵条件进行了优化。采用Plackett-Burman实验设计考察关键发酵操作参数对产酶的影响。继而采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并结合中心组合实验和响应面对4个显著性因素进行分析。Plackett-Burman实验结果表明,发酵温度、装液量、麦麸和 (NH4)2SO4浓度对β-葡萄糖苷酶合成影响显著。通过响应面分析得到一元二阶方程,对方程求解得到优化的发酵过程参数：发酵温度为28 ℃,装液量为71.4 mL/250 mL,麸皮浓度为36 g/L,(NH4)2SO4浓度为5.5 g/L。采用该优化的过程参数,菌株的最大产β-葡萄糖苷酶活力可达60.06 U/mL,较优化前提高了23.9％。将黑曲霉HDF05产生的β-葡萄糖苷酶用于酸解玉米芯纤维残渣的酶解实验中,可明显降低纤维二糖的积累,48 h内可使玉米芯纤维素残渣酶解得率达到80.4％。     

啤酒糟固态发酵产β-葡萄糖苷酶的研究

利用啤酒糟为培养基对黑曲霉固态发酵产β-葡萄糖苷酶的工艺条件进行了优化和动力学研究。单因素试验表明,最适产酶温度、料液比和接种量分别为30℃、1∶5(啤酒糟∶水,g∶mL)和10%(mL/g);利用L9(34)正交试验优化反应条件,结果表明,在25℃,初始料水比为1:5,接种量10%的条件下,培养4d,β-葡萄糖苷酶的酶活可达10.85U/g。动力学研究表明,β-葡萄糖苷酶在96h进入产酶的高峰期,120h达到酶活最大值。     

复合诱变黑曲霉选育β-葡萄糖苷酶高产菌株

对黑曲霉原生质体进行紫外、ＬｉＣｌ复合诱变,观察诱变后原生质体再生菌落,发现了抱子颜色变异较大的菌株,且其变化与酶产量相关。经发酵筛选,获得卜葡萄糖昔酶活较高菌株,其酶活由出发菌株的１０ｕ／ｍｌ提高到１４．７ｕ／ｍｌ。再对高产突变株进行氮离子注入,酶活又提高２０％（达１７ｕ／ｍｌ）。     

黑曲霉原生质体诱变选育β-葡萄糖苷酶高产菌株

本研究报道了以原生质体诱变技术选育高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株,并研究了其发酵特性。以黑曲霉CGMCC3.316为出发菌株,通过紫外诱变得到突变株3-3M。然后以3-3M为供试菌株,研究了其原生质体制备与再生的条件。最后通过原生质体诱变,选育得到一株β-葡萄糖苷酶活力较高的突变株60B-3D。该菌株具有良好的遗传稳定性,酶活力平均达到23IU/mL,与出发菌株CGMCC3.316相比提高39%。此外,该菌株的木聚糖酶活力也有所增加。同时考察了黑曲霉60B-3D的发酵特性,并与3-3M和出发菌株进行比较,结果表明该菌株有较高的蛋白分泌能力。本研究为发酵生产β-葡萄糖苷酶提供了一株良好的供试菌株。     

产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选鉴定及其离子束诱变

利用经过改良的初筛培养基,以p-NPG为底物作为筛子,从葡萄园土壤及葡萄表皮中筛选到一株产β-葡萄糖苷酶酶活较高的茵株,经18S rDNA鉴定为黑曲霉.通过离子束注入技术对该茵株进行诱变,获得了一株高产β-葡萄糖苷酶诱变菌株H68,与原茵株相比,酶活提高了53%.     

黑曲霉生产β—葡萄糖苷酶发酵条件的研究

经多项式回归分析,研究了不同浓度Ｎ源、Ｃ源、无机盐等对酶产量的影响,确定出最佳培养基配方为：麸皮４．９％,（ＮＨ４）２ＳＯ４０．４％,ＫＨ２ＰＯ４０．２９％,ＣａＣｌ２０．０５％,ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０４％,ＦｅＳＯ４·７５ｍｇ·Ｌ＾－ＺｎＣｌ２１．４ｍｇ·Ｌ＾－,０．２％油酸钠。并对培养温度１时间、培养基初妈ｐＨ、通气量、接种量、接种方式等培养条件进行优化,使黑曲霉生产β－葡萄糖苷酶的产量由     

补料发酵法制备β-葡萄糖苷酶的研究

研究了黑曲霉制备β-葡萄糖苷酶液态发酵过程中添加麸皮和纤维二糖的补料工艺.补料量及补料次数影响着β-葡萄糖苷酶的分泌.经过四次补加1%菌麸皮干粉,发酵液中β-葡萄糖苷酶活力由未补料的1.72 U/mL增加到5.07 U/mL,提高了近3倍.而且,添加麸皮浸提液能达到同样效果.采用分批补料工艺产酶时,初始浓度为3%的麸皮用量比较适宜,其蛋白含量和β-葡萄糖苷酶的活力均为最高,分别达到0.69nag,/mL和7.00 U/mL.在补料总量和补料次数相同的情况下,以递减方式补料效果最好,产酶达7.34 U/mL.补加纤维二糖对β-葡萄糖苷酶的分泌具有一定的诱导作用,在接种培养48h时补加0.2%纤维二糖比较适宜.研究表明,分批补料发酵有利于黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶,是一种很好的提高酶产量的方法.