一种受抗生素诱导的启动子的构建及活性分析

多聚ADP核糖聚合酶（PARP）受基因毒剂的特异性诱导。将拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtPARP1基因上游长2179bp的启动子片段插入到质粒pAKK687的β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）报告基因上游,转化拟南芥。GUS组织化学染色结果表明,GUS报告基因仅在苗龄3-5天的拟南芥根部及花发育早期的雄蕊中表达;1.5μg.mL-1博莱霉素与22μg.mL-1丝裂霉素联用强烈诱导了GUS报告基因的表达（尤其在拟南芥的幼苗和果荚中）。进一步降低抗生素浓度,发现单独使用1μg.mL-1博莱霉素对GUS报告基因也具较强的诱导活性,且对拟南芥幼苗的生长无影响。上述结果表明,AtPARP1启动子是一个新型的具较大应用潜力的抗生素诱导型启动子。     

水稻RPR1启动子片段对烯丙异噻唑诱导响应性的分析

烯丙异噻唑是一种合成化合物,可诱导植物产生广谱抗病性。水稻中的RPR1（dee probenazoleresponsive）基因可能参与了烯丙异噻唑诱导抗病的过程。本研究用5’端删除的方法克隆了RPR1基因的5个不同长度的启动子片段（2416bp、1574bp、819bp、568bp、208bp）,将其分别与GUS基因融合后转化拟南芥和水稻愈伤组织。结果表明,除208bp片段外,其余各片段在水稻愈伤组织中可受烯丙异噻唑诱导而驱动GUS基因的表达：1574bp和2416bp序列在异位表达系统的拟南芥中可驱动GUS的表达,说明单子叶和双子叶植物在烯丙异噻唑诱导获得抗病性的过程中可能存在某些共同机制;另外,1574bp和2416bp片段只驱动GUS在拟南芥芽顶端分生组织和叶柄中表达,说明这2个片段中可能含有调控组织特异性表达的顺式作用元件。这些烯丙异噻唑应答片段的鉴定为构建可用于基因表达分析,特别是田间可诱导基因表达系统提供了基础。     

拟南芥砷诱导基因At4g13180的表达模式研究

拟南芥(Arabidopsis thaliana)砷诱导基因At4g13180编码蛋白是短链脱氢酶(Short-Chain Dehydrogenase/Reductase Superfamily,SDR)家族的成员之一,其过表达可以增强植物对过氧化氢的耐受性。该实验通过半定量RT-PCR,构建ProAt4g13180:GUS、At4g13180-EGFP和At4g13180-OE表达载体,获得At4g13180基因过表达转基因株系,并研究了At4g13180基因的表达模式及其编码蛋白的亚细胞定位。结果显示,At4g13180基因在根尖、叶脉、萼片和花丝等组织都强烈表达,该基因编码蛋白主要定位于胞质和核中。该研究结果为深入探究拟南芥砷诱导基因At4g13180的功能奠定了一定的基础。     

拟南芥中一个类似钙调素蛋白的基因结构及其缺磷、缺钾诱导表达

通过拟南芥芯片杂交分析发现推测的钙调素基因(GenBank accession No.Atlg76650)与低磷胁迫有关.对该基因的结构研究确认了该基因编码一个含有三个EF-hand结构域的类似钙调素的蛋白,Northern检测表明该基因在缺钾、缺磷条件下诱导表达,但在缺氮、高盐等胁迫条件下不受影响.经RT-PCR和启动子融合GUS转基因植株的组织化学染色分析,表明该基因在拟南芥中为全株表达,但各器官中表达丰度不尽相同.     

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子逆境诱导表达特性研究

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因启动子(S6PDHp)的逆境诱导表达特性,利用Gateway技术构建了S6PDH基因启动子区5'端系列缺失体与GUS基因的融合表达载体,并通过农杆菌介导法转化拟南芥。对转基因拟南芥进行低温和外源ABA处理,通过GUS蛋白活性变化分析S6PDHp的逆境诱导表达特性。研究结果发现,通过Gateway技术构建了4个S6PDHp 5'端系列缺失体与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的融合表达载体(pGWB433-S6PDHp1、pGWB433-S6PDHp2、pGWB433-S6PDHp3和p GWB433-S6PDHp4)并获得了相应的转基因拟南芥。对转基因植株进行低温处理后发现,p GWB433-S6PDHp3转基因植株中的GUS活性增幅最大,达到显著水平,而其他转基因植株中的GUS活性基本保持不变。外源ABA处理后发现,除p GWB433-S6PDHp4外,其余启动子缺失体转基因拟南芥中GUS活性显著升高。以上结果表明,低温和外源ABA能够诱导S6PDHp的表达,但不同的缺失体响应程度不同,意味着在S6PDHp序列(-2 396bp至-236bp)中可能存在着响应逆境胁迫的正负调控顺式作用元件。     

盐角草磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因（SePEAMT）启动子的克隆及瞬时表达

磷酸胆碱是合成磷脂酰胆碱和甘氨酸甜菜碱的重要前体,磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（PEAMT）是磷酸胆碱合成的关键酶。根据已知的SePEAMT cDNA5'端序列设计两个基因特异的反向引物(PP1,PP2),通过锚定PCR获得了PEAMT起始密码子上游1249bp的序列。RLM-RACE反应确定其转录起始位点A位于起始密码子上游301bp处,由此获得了948bp的SePEAMT启动子序列。PlantCARE和PLACE在线启动子预测工具分析表明：该序列除了含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box外,还含有一些胁迫诱导元件（如ABRE、HSE、LTR）和花粉特异的激活元件AGAAA。构建了SePEAMT启动子与报告基因GUS 融合的表达载体pPro,并通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,染色结果表明SePEAMT启动子可以有效地驱动GUS基因的瞬时表达。     

拟南芥AtNHX6基因启动子的克隆及表达分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体AtNHX6基因的组织表达模式,从基因组中克隆了AtNHX6基因开放阅读框(ORF)上游侧翼调控区1 922bp序列,并成功构建AtNHX6基因启动子与GUS融合表达载体pCAM-BIA1381-proNHX6-GUS,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得T3代纯合转基因拟南芥株系,经PCR检测扩增得到2 187bp目的条带。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式发现,在子叶、下胚轴和花中GUS活性显著。在这些广泛表达的部位中,微管系统中的表达最为显著,真叶中只有局部检测到GUS表达;在根中GUS在根毛和侧根生长部位表达;在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS活性,成熟果荚中只在果柄检测到GUS表达;在花中,雄蕊的花丝和花粉粒及雌蕊的柱头中检测到GUS表达。GUS染色分析结果表明,AtNHX6基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达,且AtNHX6基因主要在拟南芥的子叶、下胚轴、根、花、果荚中的微管系统、根毛和侧根生长部位以及花丝、花粉、柱头中表达。     

双管基因枪介导的基因瞬时表达技术在拟南芥中的应用

基因瞬时表达是植物中研究目标基因功能的常用手段。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,相比原生质体和农杆菌介导的基因异源表达技术,利用粒子轰击进行基因瞬时表达一直鲜有报道。其主要原因是拟南芥叶型相对较小、基因枪操作相对烦琐以及基因表达效率差异较大。该研究通过优化双管基因枪系统,在营养生长旺盛的拟南芥莲座叶中实现GFP和GUS基因高效表达。同时,通过GUS报告基因明确了坏死诱导因子BAX、Avh238和ATR13/Rpp13激发拟南芥细胞坏死的表型。但在本氏烟(Nicotianabenthamiana)中明显诱导细胞坏死的Avrblb1/RB基因对,在拟南芥中却丧失了诱导细胞坏死的活性。由于双管基因枪系统每次轰击时设置平行对照,可有效降低转化实验中的样本变异度,为拟南芥及其突变体研究中准确评价基因功能和高通量筛选目标基因提供新的技术参考。     

拟南芥PR-1基因启动子的克隆与植物表达载体的构建

根据已报道的拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）病程相关蛋白基因（PR-1）序列设计引物,通过PCR技术从拟南芥中扩增得到水杨酸诱导表达的PR-1基因启动子片段,序列分析表明,该启动子含910bp核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99．7％：将该启动子构建到植物表达载体pB1121上,获得病程相关蛋白基因（PR-1）启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体pBI-prlp,将其转入根癌农杆菌GV3101,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,为深入研究寄主-病原物相互作用的分子机理奠定基础。     

APETALA1启动子驱动AtIPT4在转基因拟南芥中表达导致花和花器官发育异常

细胞分裂素对拟南芥（Arabidopsis thaliana）花分生组织细胞的分裂和分化具有重要作用。本研究利用APETALA1（AP1）特异启动子在花分生组织和第1、2轮花器官中表达细胞分裂素合成酶（isopentyl transferase,IPT）基因IPT4,研究细胞分裂素对花和花器官发育的影响。在pAP1∷IPT4转基因植株中出现了花密集和花器官数目增多等现象。原位杂交和GUS组织染色结果发现,在pAP1∷IPT4转基因植株中,花分生组织特征决定基因LEAFY（LFY）与花器官特征决定基因AP1、PISTILLATA（PI）和AGAMOUS（AG）的表达量均有不同程度的提高。研究结果表明在拟南芥中表达pAP1∷IPT4影响其花和花器官的正常发育。