不结球白菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及表达

从不结球白菜CMS新种质中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段,采用RT-PCR和RACE技术成功克隆了一个α-微管基因的cDNA全长序列,命名为TUBA2(DDBJ登录号为AB445012)。序列分析结果表明,该基因全长1 709 bp,最大开放阅读框为1 353 bp,编码450个氨基酸序列,与已公布的α-微管基因有较高的同源性。系统进化树分析发现,该基因在不同植物间具有高度保守性。Southern杂交表明TUBA2属于不结球白菜多基因家族的一个单一克隆基因。实时定量RT-PCR检测表明,该基因在不育系中的表达量显著低于保持系,同时在不同组织和细胞减数分裂不同时期该基因的表达量也存在明显差异。     

胞质雄性不育相关基因的克隆及其表达分析

根据GenBank中orf224和atp6基因的保守序列设计特异引物,对不结球白菜Pol胞质雄性不育系的基因组DNA进行特异扩增,获得了Pol胞质雄性不育的特异基因orf224和atp6的DNA序列.用Blastn在GenBank中进行同源性比对分析,发现不结球白菜orf224c和atp6c基因与已报道的orf224和atp6基因的同源性高达100%,在GenBank中的登录号依次为DQ400846、DQ412559.运用半定量RT-PCR对orf224c基因在不同器官中的表达水平进行分析,结果表明:不育系花期叶片中该基因的表达量比长度小于0.5 mm蕾和雄蕊中的明显低,在后2个器官中的表达量无明显差异;而在保持系的上述3个器官中的表达量无明显差异.该结果显示orf224基因表达上调与孢原细胞分化受阻相关.     

不结球白菜热激蛋白基因克隆及表达

从不结球白菜'暑绿'中克隆到一个受热激诱导的小分子量热激蛋白(sHSP)基因,命名为BcHSP(DDBJ登录号为AB367955),该基因核苷酸序列全长722 bp,编码157个氨基酸,与芜菁、芥蓝、拟南芥等有90%以上的相似性.实时定量检测表明,不结球白菜BcHSP转录表达受热激诱导,以叶片中表达量最高,BcHSP在不结球白菜叶片中表达特征说明它可能与植物叶片的耐热性关系更为密切.     

不结球白菜抽薹性状的配合力及遗传效应研究

目前育种者对不结球白菜育种的研究主要集中在夏季及秋冬季弱冬性品种上,对适宜春季栽培的不结球白菜耐抽薹性的育种研究鲜有报道,然而市场对不结球白菜的周年生产要求迫切。本研究通过对不同抽薹期基因型的不结球白菜的配合力及遗传力进行分析,为不结球白菜耐抽薹时期的筛选及新品种的选育提供理论依据。本研究采用Griffing完全双列杂交方法 I对4个不结球白菜自交系抽薹性状的配合力进行分析,并对其抽薹性状的遗传参数进行估算。结果表明:自交系M11-1-2和M11-1-4的一般配合力均较好,具有作为耐抽薹亲本材料的潜力;抽薹期性状的广义遗传力和狭义遗传力分别为97.42%和91.41%,抽薹性状主要受加性效应基因控制,因此,在早世代对不结球白菜抽薹性状的选择是有效的途径。     

不结球白菜金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

通过RACE技术,从不结球白菜抗病品种‘苏州青’叶片克隆到金属硫蛋白(metallothionein)基因的全长cDNA序列(BcMT2)。序列分析结果表明,BcMT2基因的cDNA全长为528 bp,其中开放阅读框长度为243 bp,共编码80个氨基酸,相对分子质量为8.02×10³ Da,理论等电点是4.61。氨基酸同源系统进化分析表明,不结球白菜BcMT2基因属于Ⅱ类植物MT2基因家族,且与同科植物的进化关系相近,其中与大白菜第5号染色体的基因(Bra029765)相似性最高(100%)。qRT PCR分析表明,BcMT2基因在不结球白菜叶中表达最强;霜霉病菌诱导后,BcMT2基因在抗病品种‘苏州青’中的表达量于48 h达到峰值,而在感病品种‘矮脚黄’中的表达量于72 h达到峰值;盐处理条件下,BcMT2基因在抗病品种‘苏州青’中的表达量于12 h达到峰值,而在感病品种‘矮脚黄’中的表达量于24 h达到峰值;ABA处理下,‘苏州青’中其表达量于24 h达到峰值,且在‘矮脚黄’中BcMT2基因的表达趋势与‘苏州青’类似;干旱处理条件下BcMT2基因的表达在两材料中均受到抑制。BcMT2原核表达分析发现,在37 ℃、1.0 mmol·L^-1IPTG诱导2、4 、6 h后,均检测到了一条蛋白分子质量约为8×10³ Da的表达特异条带,这与预期融合蛋白的相对分子质量的理论值8.02×10³ Da相符。研究表明,不结球白菜BcMT2基因在受到生物胁迫和非生物胁迫等逆境条件下均发挥着重要作用,且BcMT2在大肠杆菌中成功实现融合表达,为进一步进行蛋白水平和转基因功能研究奠定了基础,也为选育高产、优质的不结球白菜新品种提供重要的理论依据。     

不结球白菜BcTuR1基因的克隆及表达

从不结球白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)品种‘短白梗'中克隆到一个抗TuMV相关基因,命名为BcTuR1(GenBank登录号FJ600374).该基因核苷酸序列全长1 019 bp,编码162个氨基酸.BcTuR1基因与芥菜抗病毒基因相似性最高为96%,其它没有与该基因相似性高于50%的序列.基因组DNA杂交表明,BcTuR1可能属于一个较小的多基因家族.实时定量PCR检测表明,芜菁花叶病毒能够诱导不结球白菜BcTuR1基因的转录表达,其在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病毒的抗性.     

不结球白菜BcTuRsO基因的克隆及表达

从不结球白菜抗病品种短白梗中克隆到一个抗芜菁花叶病毒(TuMV)相关基因,命名为BcTuRsO(Gen-Bank登录号FJ600376).该基因核苷酸序列全长650 bp,编码194个氨基酸,与已克隆的抗病基因有不同程度的同源性.系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性.基因组DNA杂交表明,BcTuRsO基因可能以单拷贝形式存在,其表达是组成型的.实时定量PCR检测表明,芜菁花叶病毒能够诱导不结球白菜BcTuRsO基因的转录表达,其在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病毒的抗性.     

香蕉BTB/POZ域基因的克隆及表达分析

利用抑制缩减杂交文库从香蕉中分离获得一个cDNA片段,结合RACE技术获得该基因的全长序列,命名为MaBTB基因,该cDNA的ORF全长1 080个碱基。通过Blastx同源性分析结果显示该基因的氨基酸序列与水稻OsBTB、苜蓿MtBTB/POZ、拟南芥AtBPM4、葡萄VvBTB、玉米ZmBTB 、松树PsBTB基因的氨基酸序列同源性很高,分别为86%、85%、84%、84%、86%和87%。遗传进化树分析发现该基因与苜蓿MtBTB/POZ和拟南芥AtBPM4基因亲缘关系较近。用RT-PCR的方法研究该基因在不同胁迫处理下的表达特性,结果表明该基因在盐、乙烯和紫外线处理后其表达量逐渐增强;低温处理和香蕉尖孢镰刀菌4号生理小种处理后该基因表达量开始降低,随后逐渐升高;伤害处理后该基因的表达量没有明显变化。     

湖北海棠MhPR1a基因的克隆与表达特性分析

以水杨酸诱导的湖北海棠[ Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.]全长cDNA文库和基因组DNA为模板,克隆其PR1a基因(MhPR1a)的全编码区序列,并对该序列进行生物信息学分析;在此基础上利用荧光定量RT-PCR技术对湖北海棠根、茎和叶中该基因的表达特性及经过10μmol·L-1ABA、4℃低温处理及苹果蚜虫(Aphis citricola van der Goot)侵染后叶中该基因的表达特性进行了测定.结果表明:克隆获得的MhPR1a基因全长518 bp,最大开放阅读框为492 bp,编码162个氨基酸残基;编码的蛋白质为酸性蛋白,其相对分子质量为16 960,等电点pI 5.46;其基因组DNA序列与cDNA序列完全一致,说明MhPR1a基因内部没有内含子.湖北海棠MhPR1a基因与苹果(M.domestic Borkh.)和沙梨[Pyrus pyrifolia( Burm.f.)Nakai] PR1基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列同源性均较高,其中cDNA序列的同源性均为97％,氨基酸序列的同源性分别为95％和97％;系统树也显示MhPR1a基因编码的氨基酸序列与苹果和沙梨的亲缘关系最近,聚为一类.MhPR1a基因编码的氨基酸序列具有SCP保守结构域,含有1个信号肽和6个保守的半胱氨酸残基.在湖北海棠的叶、茎和根中MhPR1a基因均能表达,在根中的表达量最高.10 μmol·L-1ABA和4℃低温处理48 h后均可诱导MhPR1a基因的表达,且相对表达量明显高于对照(处理0h);苹果蚜虫也可诱导MhPR1a基因的表达,说明MhPR1a基因在湖北海棠抵抗植食昆虫和低温胁迫的过程中可能发挥着重要作用.     

不结球白菜BcDF1.2基因克隆与诱导表达

利用RACE技术,获得了不结球白菜防卫素基因全长序列,命名为BcDF1.2(DDBJ登录号AB302891).序列分析发现,BcDF1.2全长532 bp包含1个长度为96 bp的内含子区域,该基因编码79个氨基酸残基组成的蛋白质,与其他植物的防卫素基因和抗真菌蛋白基因有较高的同源性.系统进化树分析表明,该基因在不同植物间具有高度保守性.基因组DNA杂交表明BcDF1.2属于较小的多基因家族.水杨酸和霜霉病原菌诱导后,该mRNA不仅在诱导的叶片中转录表达增加,而且在未诱导的系统叶片中表达增加.BcDF1.2在不结球白菜叶片中的转录表达特点表明可能参与对霜霉病的抗性反应.