猪IGF-Ⅰ基因荧光定量PCR标准曲线的建立

目的:建立用荧光定量PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。方法:根据自己克隆的猪IGF-Ⅰ(GenBankNo.DQ784687)基因mRNA序列,设计合成引物和探针,采用Taqman探针荧光定量RT-PCR的检测方法,构建检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。结果:由pMD-18T IGF-Ⅰ所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102~1×106拷贝猪IGF-Ⅰ基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠。结论:成功构建了用荧光定量RT-PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。     

GHR基因敲除香猪的鉴定及生长指标测定

为获得纯合的GHR基因敲除香猪的种群,本研究以贵州从江香猪为母本,中国农业大学提供的GHR基因敲除猪(GHR(+/-))为父本杂交选育F1代,筛选出F1代阳性杂合子猪和阴性猪,再用F1代阳性杂合子猪进行扩繁得到F2代。测定F1代和F2代猪的生长指标,同时检测F1代和F2代阳性猪。实验结果表明F1代GHR基因敲除阳性猪(GHR+/+)和阴性猪(GHR+/-)生长指标差异均不显著(p0.05)。F2代GHR基因敲除猪在3月龄时体长、体重存在显著差异(p0.05),F2代4月龄阳性猪与阴性猪各项指标均差异显著(p0.05)。测序结果显示F1阳性杂合子猪共11头,阴性猪15头;F2阳性纯合子猪共8头,阴性猪9头。     

经济动物基因工程取得重要实破

继1983年构建“超级鼠”获得成功后,美国科学家又用基因工程方法将人生长激素基因整合到绵羊和猪受精卵基因中,然后再将其放回到绵羊和猪的子宫内着床发育,从而获得比现有的绵羊和猪大两倍的“超级羊”、“超级猪”。     

五指山小型猪不同器官内猪内源性反转录病毒的存在与表达

目的:检测五指山小型猪不同器官内猪内源性反转录病毒(PERV)的存在与表达情况。方法:提取心、肝、脾、肺、肾、胸腺等6种器官基因组DNA与总RNA,用PCR、反转录PCR对PERV结构基因gag、pol、env进行定性检测,用实时定量反转录PCR对pol基因进行相对定量检测。结果:6种器官中均能检测到PERV结构基因gag、pol、env的存在与表达;从m RNA水平上看,不同器官内pol基因的相对表达量不存在显著性差异。结论:五指山小型猪不同器官内PERV存在与表达的检测,对进一步阐明五指山小型猪来源的PERV分子生物学特性及深入评价猪-人异种移植病原安全性具有重要意义。     

带有猪生长激素基因的转基因鼠

为研究外源基因在转基因动物中的整合及表达调控的机制,我们首先进行了转基因鼠的研究。(a)外源基因片段的制备:把羊金属硫蛋白启动基因(SMT)和猪生长激素基因(PGH)与载体质粒pUC19相连接,构建成psMTPGH表达质粒。用BglI全酶切和     

猪FUT1基因对肉质和胴体性状的影响

测定139头杂交猪(大白猪和梅山猪)的14个肉质性状和8个胴体性状,用PCR-RFLP方法检测FUT1基因型。分析猪FUT1基因型间肉质和胴体性状差异,发现AA基因型猪3个部位肌肉pH值均比AG基因型的高,其中pH(LD)达到显著水平(P<0.05)。AA基因型猪肌肉系水力显著高于AG猪的系水力(91.02% VS 86.70%,P<0.05)。AA基因型猪的肉色值显著高于AG猪的(P<0.05)。AA基因型猪三个部位肌肉膘厚值均较低,其中最后肋骨膘厚和倒数三四肋骨膘厚分别比AG基因型猪的低4.26 mm和3.96 mm(P<0.05)。AA基因型猪瘦肉率比AG基因型猪的高3.31% (53.46% VS 50.15%,P<0.05)。以上结果表明FUT1基因的AA基因型对肉质和和胴体性状具有显著的正遗传效应,这对于在抗病育种中应用该基因十分有利。     

猪UCP3基因部分编码区序列分析及其单核苷酸多态与胴体、肉质性状的遗传效应

以猪解耦联蛋白基因 3(UCP3)作为控制猪胴体与肉质性状主基因的候选基因。利用直接测序法对 4个品种猪骨骼肌中UCP3基因的部分编码区序列 (第 4外显子部分及第 5、6、7外显子全部片段 )进行比较分析 ,发现3个cSNP位点 ,其中ORF中第 84 2碱基的突变可导致相应编码氨基酸序列的改变 :甲硫氨酸→苏氨酸 ,选取此位点作为猪UCP3基因的多态位点。用PCR SSCP检测方法在 3个品种猪中进行该cSNP位点多态性片段的基因型分型 ,结果显示在 3个猪群中表现出 3种基因型 (AA、AB、BB) ,χ2 独立性检验结果表明 3种基因型在各品种间分布不一致 ,梅山猪同大白、长白猪分别比较差异极显著 (P <0 0 1) ;对大白×梅山资源家系F2 代 139头个体进行了该多态片段的基因型鉴定 ,并对其基因型与所检测个体相应的胴体、肉质性状采用GLM分析进行遗传效应研究 ,结果表明 :该基因对一些胴体、肉质性状有显著性影响 ,并且该基因以加性效应为主 (如 ,眼肌高度、背最长肌色值、系水力的加性效应都达显著水平 )。因此 ,推测UCP3基因可能是影响猪胴体及肉质性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因 ,并且能够在分子标记辅助选择中用于对猪胴体、肉质性状的遗传改良及固定     

猪MyoG基因3′端PCR-SSCP遗传多态性及其遗传效应(英文)

采用PCR-SSCP方法对长白猪、大白猪、杜洛克猪、山西黑猪和马身猪共636头猪的肌细胞生成素(Myogenin,简称MyoG)基因3′端的遗传多态性进行检测,分析MyoG基因对猪的初生体质量、断奶体质量、6月龄体质量和背膘厚的影响。根据已发表的猪MyoG基因3′端侧翼序列设计3对引物,发现F1/R1引物对扩增的片段有多态性。统计结果发现:长白、大白、杜洛克猪种B基因为优势基因,其基因频率分别为0.8807、0.7256和0.8581;山西黑猪种A基因为优势基因,其基因频率为0.9359;马身猪种只检测到A基因。χ2独立性检验表明,基因型分布在外来猪种(长白猪、大白猪、杜洛克猪)与地方猪种(山西黑猪、马身猪)间存在极显著差异(P<0.01)。固定效应模型分析结果表明,初生体质量基因型间差异显著(P<0.05),而断奶体质量、6月龄体质量和背膘厚基因型间差异不显著(P>0.05)。最小二乘分析结果表明,BB基因型与其它2种基因型比较有较大的初生质量,同AA和AB型比较差异极显著(P<0.01)。因此,推测MyoG基因对个体的初生体质量存在一定的影响,选择带有B等位基因的个体有望提高个体的初生体质量。     

屯昌猪MYLPF基因序列分析及其组织表达量检测

为获得屯昌猪MYLPF基因的CDS区序列并分析其分子结构特征,研究屯昌猪、杜洛克猪以及其杂交F1代猪不同组织中的MYLPF mRNA表达水平,本研究以GenBank上公布的猪MYLPF基因序列(登录号:NM_001006592)为参考设计引物,通过RT-PCR扩增、测序获得屯昌猪MYLPF基因CDS区.结果显示:该基因...     

猪干扰素-α基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:克隆与分析猪干扰素-α(INF-α)基因,构建猪干扰素基因的高效植物表达载体。方法:根据NCBI中DQ248997序列设计引物,以猪的总DNA为模板,PCR扩增出猪的INF-α基因,克隆至pBS-T载体后进行序列分析,构建猪干扰素基因的植物表达载体。结果:实验所克隆序列经Blastn比对,98%的核酸序列相同,98%的蛋白质序列相同,3个非功能性氨基酸与基因库中序列不一致,推测为猪INF-α的一个亚型。构建的2个植物表达载体经BamHⅠ/SacⅠ限制性内切酶消化,均可得到570bp的目的基因。结论:成功克隆了猪的INF-α基因,并构建出含猪INF-α基因的高效植物表达载体pBI121/INF和pCAMBIA1301/INF。     

HMG_(17)非组蛋白与转录活性基因的关系

 用核内蛋白质与经0.4mol/L NaCL抽提后的细胞核重组,以DNA酶I消化法为测定活性基因的指标,观察猪胸腺HMG_(17)非组蛋白对细胞核中活性基因的影响。结果显示:猪胸腺HMG_(17)使细胞核对DNA酶I作用的敏感性增加,因此认为HMG17为使细胞核胞核中基因呈较大活性的重要因素。     

猪Musclin基因的组织表达特征及其与生脂基因的相关性分析

根据人、大鼠、小鼠Musclin基因序列设计引物,从大白猪肌肉组织提取总mRNA, R T-PCR扩增猪Musclin cDNA;利用半定量(Semi Quantitative, SQ) RT-PCR检测猪Musclin mRNA在不同组织、以及不同生长阶段和不同品种猪脂肪与肌肉组织中的表达量,研究不同品种猪皮下脂肪组织Musclin基因与脂肪酸合成酶(FAS)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PP ARγ)、甘油三酯水解酶(TGH)基因mRNA表达量的相关性.结果表明:猪Musclin基因片段与其他物种的同源性达59%以上, 该基因在内脏脂肪和皮下脂肪表达丰度最高,脾脏表达量最低(P<0.05);随月龄增长猪肌肉和皮下脂肪组织中Musclin mRNA表达量呈显著下降( P<0.05) ;瘦肉型猪肌肉和皮下组织Musclin mRNA表达显著高于脂肪型猪(P<0.05);皮下脂肪组织中该基因mRNA表达与FAS、PPARγ分别呈显著负相关和正相关(P<0.05),与TGH相关性不显著 (P>0.05).因此,猪Musclin基因除在肌肉中表达外,在脂肪等其他组织也能表达 ;该基因的表达与猪生长阶段、品种有关,且与生脂基因FAS、PPARγ密切相关.推测该基因可能在脂代谢中起到一定的作用 [动物学报 54(3):453-459,2008].     

猪IGF-I基因荧光定量PCR标准曲线的建立

目的建立用荧光定量PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.方法根据自己克隆的猪IGF-Ⅰ(GenBankNo.DQ784687)基因mRNA序列,设计合成引物和探针,采用Taqman探针荧光定量RT-PCR的检测方法,构建检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.结果由pMD-18TIGF-Ⅰ所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102～1×106拷贝猪IGF-Ⅰ基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠.结论成功构建了用荧光定量RT-PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.     

猪核糖体蛋白基因RPLP0的cDNA全长、染色体定位和多态性分析

RPLP0基因编码酸性核糖体磷蛋白大亚基P0, 是核糖体60S亚基的组成成分之一。从本室构建的猪胚胎骨骼肌cDNA文库中分离得到猪RPLP0基因的全长cDNA,并提交 GenBank 数据库。比较猪 RPLP0 基因和人及小鼠同源基因的cDNA序列和蛋白质序列,结果表明该基因在 3 个物种中具有高的相似性。用 PCR-RFLP 方法在猪 RPLP0基因cDNA 545处检测到 C→A 的单碱基突变,为 Csp6Ⅰ的酶切位点。统计分析结果表明 3 种基因型 (AA,AC,CC)在外来品种杜洛克,大约克, 长白和中国地方品种通城猪,小梅山,玉山猪中的分布各不相同。同时使用体细胞杂种板(SCHP)和辐射杂种板(IMpRH) 对 RPLP0 基因进行染色体定位,该基因被定位于 SSC 14q22-q24 并且和SW1321微卫星标志紧密连锁 (25cR, LOD = 14.54)。     

广西巴马小型猪SAP真核表达载体的构建及胚胎水平表达

本研究的目的是构建广西巴马小型猪SAP真核表达载体并在胚胎水平对其进行验证。利用RT-PCR技术扩增并克隆SAP基因,再用T4连接酶将其连入P-Dsred-N1载体,构建P-Dsred-N1-SAP载体,并通过胞质注射生产转SAP的猪胚胎。结果表明,本研究成功构建了P-Dsred-N1-SAP重组载体,经胞质注射后在胚胎发育早期和囊胚期均有红色荧光表达。本研究为下一步研究SAP基因的功能和生产转SAP基因猪奠定基础。     

猪瘟病毒感染猪白细胞凋亡基因表达谱变化的研究

为了了解CSFV感染引起猪细胞凋亡的分子机制,利用基因芯片分析了猪感染CSFV前后基因组转录水平的变化。分离攻毒前和攻毒后猪外周血白细胞(Peripheral blood leucocyte,PBL),提取总RNA,经反转录和体外转录得到cRNA,与Affymetrix猪全基因组cDNA芯片进行杂交分析,筛选差异表达的凋亡基因。结果显示,感染猪的PBLs中共筛选到24个涉及细胞凋亡有关基因发生2倍以上变化,并对差异表达的12个宿主细胞凋亡相关基因,用荧光定量RT-PCR进行了验证。功能分析显示,这些凋亡基因的表达变化与CSFV诱导宿主细胞凋亡的机制有关。本文首次用猪全基因组芯片研究了CSFV感染诱导宿主基因的表达变化,建立了CSFV感染猪细胞凋亡相关基因的表达谱,初步阐释了CSFV感染诱导宿主细胞凋亡的分子机制。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突糖蛋白S。方法:根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物,并在5'引物和3'引物中引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点,2.2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体,再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞,G418筛选鉴定阳性重组子,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测诱导后上清。结果:对pPIC9k-S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因;重组酵母菌诱导表达后,SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量约为82×103,且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论:利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒(河北分离株)纤突糖蛋白S。     

反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的表达

目的:利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白(APOBEC)3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达。方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中,同时于插入位点两侧分别添加FLAG和GFP标签,构建重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T,分别于转染后48~72 h收集细胞的培养上清以获得假型病毒粒子;用该假型病毒感染猪源细胞PK15,通过PCR、Western印迹检测目的基因的整合及表达。结果:PCR扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP经酶切、测序,结果无误;3质粒共转染HEK293T细胞包装出的假型病毒感染PK15细胞后观察到GFP表达;从感染假型病毒的PK15细胞基因组中扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,Western印迹检测到78.1×103的猪APOBEC3F蛋白的表达。结论:实现了反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的整合与表达,为深入研究该分子对猪内源性反转录病毒(PERV)的抑制作用奠定了基础。     

合作小型猪T细胞受体α链的基因结构及其多样性

目的探讨猪TCR基因分子结构的复杂性及其与人类的相似性。方法以公开的猪TCRα链基因为参考序列设计两对特异性引物,用RT-PCR法从合作小型猪外周血、淋巴结和脾脏的淋巴细胞中克隆了93个猪TCRα基因(简称STA)。结果测序分析表明,克隆的猪TCRα链的基因均含有可变的信号肽区和V区、高变的J区和恒定的C区的基因片段,但基因间的核苷酸序列组成都不完全相同,且具有十分复杂的多态性和多样性,基因间的同源性在68.4%~98.7%,这与TCRα链的基本基因结构特征相一致。依据TCRα基因的同源性对其分子结构、遗传演化关系和归类分析发现,在其信号肽区、FR1区和CDR1区、FR2区和CDR2区以及FR3区和CDR3区都存在一些变异集中点和变异热点区。用IMGT/V-QUEST分析方法可将合作小型猪TCRαV区(STAV)、J区(STAJ)基因片段与人类的进行比较分析,发现合作小型猪TCRα与人类的遗传演化关系较近,每个序列都能找到与人类对应的TRAV、TRAJ基因片段,甚至V区的相似性可达92%以上。结论近交培育的合作小型猪在正常状态具有应对外界复杂微生物等环境的TCR遗传多样性分子基础,且适合作为人类免疫学及疾病研究的动物模型。     

猪PID1基因CDS区的克隆及其mRNA表达与肌内脂肪沉积关系

为了探索PID1(Phosphotyrosine interaction domain containing1)基因的表达与脂肪沉积的关系,文章利用兼并引物进行RT-PCR从猪脂肪和肌肉组织中克隆PID1基因CDS(Coding region)区全序列,并采用荧光定量PCR方法对大白猪、鲁莱黑猪、莱芜猪3个猪品种的肝脏、脂肪和肌肉组织PID1基因mRNA表达进行了相对定量分析。结果表明:经克隆、测序,得到了猪PID1基因654bp全编码区序列,通过Blast比对,与人、大鼠、牛有93.88%、66.94%、88.07%的同源性。PID1基因在同一个品种猪中mRNA表达水平总体表现为:肝脏脂肪肌肉。在不同品种3种组织中PID1基因mRNA表达水平总体表现为:莱芜猪鲁莱黑猪大白猪,其中肝脏中差异显著(P0.05),但是在脂肪和肌肉组织中莱芜猪与鲁莱黑猪差异不显著(P0.05)。对于高肌内脂肪(LWH)、中等肌内脂肪(LWI)和低肌内脂肪(LWL)沉积的3组莱芜猪,PID1基因在肝脏组织中的表达水平是LWH显著高于LWL(P0.05),在肌肉组织中则是LWH显著高于LWI和LWL(P0.05)。PID1基因在莱芜猪品种内3个组织中mRNA表达量与IMF含量相关均不显著,而在品种间3个组织中mRNA表达量与IMF含量呈显著正相关(P0.05)。结果提示:PID1的表达可能与脂肪沉积性状存在一定的关系。