大鼠β乳酪蛋白基因调控区的克隆和序列分析及乳腺定位表达载体的构建

将大鼠β乳酪蛋白的调控序列克隆于ｐＧＥＭ－４Ｚ,用ＳＰ６、Ｔ７正反向引物进行序列分析,证实其正确之后将该调控序列克隆于真核表达载体ｐＳＶＬ中,构建成功了乳腺定位表达载体。同时在其下游插入了荧光素酶报道基因,用于在乳腺细胞表达调控的研究。     

人乙型肝炎病毒前表面抗原（preS）基因的突变及其在家蚕细胞中影响 …

为探讨人乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）前表面抗原（ｐｒｅＳ）基因的表达调控机理,以实现高效表达,利用ＰＣＲ方法在克隆的ｐｒｅＳ基因的第２、３位密码子引入同义突变。消除存在于５端编码区保守的反向重复序列,将ｐｒｅＳ基因及其突变形式（ＭｐｒｅＳ）分别重组到转移载体ｐＢＭ０３０,获得ｐＢＭ－ｐｒｅＳ和ｐＢＭ－ＭｐｒｅＳ。将ｐＢＭ－ｐｒｅＳ和ｐＢＭ－ＭｐｒｅＳ分别与野生型家蚕核型多角体病毒（ｂｍＮＰＶ）ＤＮＡ共转     

分泌载体pUS186的构建及地衣杆菌α—淀粉酶基因在枯草杆菌中的表…

利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列。将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒ｐＵＢ１８上,获得分泌型表达载体ｐＵＳ１８６。为了测试构建的载体ｐＵＳ１８６的功能,将地衣杆菌α－淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Ｂａｌ ３１酶切,Ｔ４ ＤＮＡ聚合酶补齐等处理,获得ｐＵＳＡ１８６Ｉ     

分泌载体pUS186的构建及地衣杆菌α－淀粉酶基因在枯草杆菌中的表达和分泌

利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克隆了枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列,将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒ｐＵＢ１８上,获得分泌型表达载体ｐＵＳ１８６。为了测试构建的载体ｐＵＳ１８６的功能,将地衣杆菌α－淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Ｂａｌ３１酶切,Ｔ４ＤＮＡ聚合酶补齐等处理,获得ｐＵＳＡ１８６Ⅱ及ｐＵＳＡ１８６Ⅰ系列质粒,将这些重组质粒转化枯草杆菌ＱＢ１１３０（ａｍｙ－）后都能向胞外分泌淀粉酶,酶活测定结果表明,基因表达水平比用原有的启动子高１－２倍,蛋白质分泌率在８４－９６％之间。     

Epstein—Barr病毒膜抗原在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达

将切去３＇端穿膜序列的ＥＢ病毒膜抗原（ＭＡ）基因,插入ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ质粒的ＳＶ４０早期启动子下游,构建了真核表达载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒＧＰＴＲ,使两个ＳＶ４０早期启动子分别调控ＭＡ和二氢叶酸还原酶（ｄｈｆｒ）基因。将该重组质粒转化ＣＨＯ－ｄｈｆｒ细胞。在选择培养基中筛选阳性克隆,用氨甲喋呤加压扩增,建立了表达ＥＢＶ－ＭＡ的克隆细胞系。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ分析证明,所表达的蛋白的分子量大约为     

牛β-乳球蛋白基因的克隆及其调控外源基因表达的研究

目的制备乳腺生物反应器所必需的乳腺特异性表达的调控序列,并验证其指导外源基因表达的能力.方法用PCR法从奶牛染色体上分5段扩增出了全长8.2Kb的牛β-乳球蛋白基因,包括1.8Kb的5′侧翼区、1.7Kb的3′侧翼区及4.7Kb的gDNA区.扩增出的各片段克隆到T-载体上,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性.将五个片段与荧光素酶cDNA拼接成荧光素酶瞬时表达载体并在小鼠乳腺中瞬时表达.结果注射荧光素酶瞬时表达载体的小鼠乳汁中明显测出了荧光素酶活性.结论所克隆的牛β-乳球蛋白基因表达调控序列能够指导外源基因在小鼠乳腺中表达.     

人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆和乳酸乳球菌中的表达

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人肝总ＲＮＡ中分离扩增了０．４５ｋｂ的人铜锌超氧化物歧化酶（Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ）基因的ｃＤＮＡ序列,首先克隆至大肠杆菌表达质粒ｐＥＴ２３ｂ,进行了序列测定和超高表达,将Ｃｕ／Ｚｎ,ＳＯＤｃＤＮＡ亚克隆至乳酸乳球菌表达载体ｐＭＧ３６ｅ,用电穿孔法将重组质粒ｐＭＧ３６ｅｓｏｄ转化到乳酸乳球菌,获得Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ的组成型表达,其表达量约占乳酸乳球菌可溶性蛋白的５％以上,活性染色表     

抗水稻矮缩病毒的反义核酶及复制酶部分序列的合成、克隆及其水稻表达载体的构建

采用反转录－聚合酶链式反应方法（ＲＴＰ－ＣＲ）,在人工合成的引物引导下,扩增出水稻矮缩病毒基因组第一片段（Ｓ１）全长序列及第五片段的部分序列（ＳＳⅢ）．将扩增的片段分别克隆到克隆载体ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）及ｐＵＣ１９的ｓｍａｌ位点上,并进行了序列测定。在此基础上,利用ｐＣＲ引入的方法将核酶序列引入到Ｓ５Ⅲ片段反义链上以构成反义核酶基因Ｓ５ⅢＲ,将Ｓ１片段５＇端部分序列（Ｓ１－１）及Ｓ５ⅢＲ基因克隆到植物表达载体ｐＲＯＫⅡ上,构建成水稻转化载体ｐＲＯＫ－Ｓ１－１＇及ｐＲＯＫ－Ｓ５ⅢＲ。     

小鼠金属硫蛋白 Ⅰ cDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ｐＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ｐＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确．再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ／Ｌ     

鲤鱼生长激素基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）改造了锂鱼生长激素基因,扩增出编码锂鱼生长激素成熟肽的序列,并将此序列克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ⅱ ＫＳ质粒中,序列分析后,亚克隆到大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０中。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描,结果表明锂鱼生长激素基因已大肠杆菌中获得表达。锂鱼生长激素成熟肽的分子量为２２０００道尔顿,表达率占细胞总蛋白的１８％以上％。     

中国人肥胖基因真核表达载体的构建

为研究肥胖（ｏｂｅｓｉｔｙ）的病因及肥胖基因（ｏｂ）的表达与调控,根据文献报道的ｈｏｂ序列设计引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增中国人的ｏｂ基因（包括信号肽在内的ｃＤＮＡ全长５４０ｂｐ）,ＰＣＲ产物采用Ｔ－Ａ克隆法首先连接到克隆载体ｐＵＣ１１９,然后定向转移到经改造的真核表达载体ｐＳＶ－β－ｌａｃＺ,酶谱分析表达克隆基因为的人肥胖基因。     

乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列的鉴定及在小鼠乳腺细胞表达LacZ基因的研究

乳清酸蛋白（ＷＡＰ）是小鼠乳中的主要蛋白质．在亚克隆该基因的基础上,对其进行了酶切鉴定,并对该基因５′区进行克隆和序列分析,在核实序列正确后,构建了以其为调控序列,指导β－半乳糖苷酶基因的真核表达质粒,采用直接注射质粒的方法在小鼠乳腺中表达出β－半乳糖苷酶活性,从而证实基因调控序列的功能正确性,可以用于转基因动物乳腺表达研究,同时证实该方法可以作为一种暂时性表达载体的验证方法．     

两种AFP阳性肝癌细胞专一基因表达调控序列的构建

构建了由人胰蛋白酶抑制基因的增强子和大鼠ａｆｐ基因启动子与沉默子组成的杂合基因表达调控序列;还构建了１．２ｋｂ的由大鼠ａｆｐ基因增强Ⅲ和ｒＰＳ组成的调控序列。将报告基因－氯霉素乙酰转移酶基因置于这些序列控制之下,构建成ＣＡＴ表达载体ＡＴｒＰＳ－ｐＣＡＴ和ｒＡＦＰ－ｐＣＡＴ。     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

链霉菌—大肠菌穿梭质袜载体pSGLgpp的构建及应用

质粒ｐＳＧＬ１（７．４ｋｂ）是从球孢链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）中分离得到的一个高拷贝质粒,已测定其最小复制子序列。从球孢链霉菌总ＤＮＡ中采用ＰＣＲ方法扩增获得编码Ｃ１０２７前蛋白信号肽的ＤＮＡ片断ｇｐｐ。将ｇｐｐ克隆至ｐＳＧＬ１的衍生质粒ｐＳＧＬＮ中,获得新的链霉菌表达型质粒载体ｐＳＧＬｇｐｐ。应用该质粒进行了人的河溶性白细胞介素１受体Ｉ型的表达。     

猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究

将猪生长激素基因（ＰＧＨ）克隆到质粒ｐＵＣ１９上,经酶切分析,确定其酶切图谱。把ＰＧＨ转录起始位点以前的序列切掉,换上羊ＭＴ－１ａ基因的启动子,构建成可以调控的表达载体ｐＳＭＴＰＧＨ,用于转基因动物的研究。采用微注射法将线状ｐＳＭＴＰＧＨ导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物。对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这３种动物中的整合率均在９％以上,其生长速度都     

小鼠4.5S RNA逆转座子对Luc基因表达的影响

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从小鼠肝脏组织总ＲＮＡ中扩增出４．５ＳＲＮＡ的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ被克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）质粒上,酶切鉴定并测序。然后将该序列插入以Ｌｕｃ基因作为报道基因的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０的ＰｖｕⅡ位点,构建了含４．２ＳＲＮＡ逆转座子的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０－４．５Ｓ。脂质转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－１、ＳＰ２／０和人乳腺癌细胞Ｂｃａ６１。结果表明,小鼠４．５ＳＲＮ     

葡萄球菌激酶（Sak）的基因克隆和高效表达工程菌的构建

利用ＰＣＲ技术,从金黄色葡萄球菌中扩增Ｓａｋ基因并将其克隆到ｐＵＣ１９质粒上,确认其碱基序列正确后,再将其亚克隆到ｐＪＷ２质粒并转化大肠杆菌ＤＨ５α获Ｓａｋ高表达工程菌（ＤＨ５α／ｐＪＳ）。试验结果表明,Ｓａｋ可占菌体总蛋白的５０％。     

猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究

将猪生长激素基因（ＰＧＨ）克隆到质粒ｐＵＣ１９上,经酶切分析,确定其酶切图谱．把ＰＧＨ转录起始位点以前的序列切掉,换上羊ＭＴ－１ａ基因的启动子,构建成可以调控的表达载体ｐＳＭＴＰＧＨ,用于转基因动物的研究．采用微注射法将线状ｐＳＭＴＰＧＨ导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物．对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这３种动物中的整合率均在９％以上,其生长速度都高于对照组．     

烟草β—1,3—葡聚糖酶cDNA克隆,大肠杆菌表达及植物表达载体的 …

用０．１５％乙烯利诱导烟草幼苗后,提取叶片总ＲＮＡ,并通过反转录及多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出β－１,３－葡聚糖酶基因的ｃＤＮＡ。将其克隆至载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ后,完成了此基因的全序列分析。测序结果表明：所克隆的ｃＤＮＡ除第１００８位碱基与所报道的不同外,其它序列完全一致。为制备抗血清,构建了此基因的大肠杆菌表达载体,并在表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙＳ中得到表达,进行了Ｗ