人胎盘催乳素多型性研究

通过纯化和分析人胎盘催乳素,发现其有两个等电点,与文献报道不一致,利用等电聚焦制备电泳分离了两个等电点组分。免疫学活性测定的结果表明,两个组分均有活性,且活性有差别,等电点高的组分,免疫学活性强。通过Ｎ端氨基酸分析发现,两组分的Ｎ端均为缬氨酸。推测人胎盘催乳素存在亚型,为进一步研究人胎盘催乳素的结构和功能以及临床上正确地利用此激素提供了有价值的依据。     

人胎盘催乳素

人胎盘催乳素（ｈＰＬ）是由人胎盘合体细胞滋养层分泌的一种蛋白质。由１９１个氨基酸组成,分子量为２２ｋＤ,基因位于第１７号染色体上。主要具有催乳和促生长作用。临床上通过测定孕妇血中ｈＰＬ进行产前监护,测定血中ｈＰＬ的含量还有助于滋养层细胞疾病的鉴别诊断和疗效观察。作者通过实验分离了ｈＰＬ的两种亚型,经检测两者免疫学活性有差别,这一结论为今后更准确地利用该激素提供了依据。     

等电聚焦法测定2.5S NGF的等电点

采用水平等电聚焦法测定了２５Ｓｍ神经生长因子（ＮＧＦ）的等电点。经测定,纯化的２５ＳｍＮＧＦ的等电聚焦为三条带,这与文献报道相一致,等电点ｐＨ值分别为ｐＨ８７、９０、９３,其主要成分为β亚基ＮＧＦ及其修饰物的混合物,包括在羧基端失去８个氨基酸残基和在氨基端失去１个精氨酸残基,由这三种组分构成的ＮＧＦ统称为２５ＳｍＮＧＦ。     

庚型肝炎病毒基因在大肠杆菌中表达的初步研究

利用原核表达载体ｐＲＳＥＴ或（和）ｐＧＥＸ在大肠杆菌内表达了覆盖庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）Ｃ－ＮＳ３或ＮＳ５区的多段基因。ＣＥ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ５及ＮＳ３－ＮＳ５嵌合基因等的８段基因均有高效表达,各重组蛋白产量与菌体总蛋白之比在１０％￣３５％之间。对以上重组蛋白进行免疫学筛选,证实其中７个重组蛋白均具免疫学活性,在一定程度上确定了重组ＨＧＶ抗原表位的分布,为ＨＧＶ的血清学和免疫学诊断试剂的研究奠定     

一组新的沙蚕蛋白酶同工酶的分离纯化与鉴定

分离纯化一组新的沙蚕蛋白酶同工酶,并对其性质进行鉴定.用硫酸铵盐析、凝胶过滤层析和疏水层析技术从沙蚕中分离得到了沙蚕蛋白酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、高效液相色谱（HPLC）、等电聚焦电泳（IEF）和质谱分析（MS）鉴定,发现沙蚕蛋白酶由3个组分组成,均有纤溶活性,其等电点为3.5～4.5,分子量分别为29 248.75、29 007.66、28 954.17,肽指纹图谱分析发现,它们均为未知的新蛋白质,其中2个组分结构相似,具有较高的同源性,与另1个有不同.用抗原抗体反应鉴定其免疫原性,发现3个组分中有2个组分具有相同的免疫原性,另1个组分与2者不同.但3者具有相同的抗原决定簇,证明沙蚕蛋白酶由2个同工酶组成.以4种专一性的抑制剂对其进行抑制,检测酶的活性确定其酶学性质,发现其反应的适宜温度为40℃～50℃、适宜pH值为8～9.沙蚕蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶.     

一种新阿片肽的分离纯化

报道了一种新阿片肽OP1的分离纯化。将重组毕赤酵母经适宜的生长和表达培养后,所得的发酵液经离心得无细胞上清液,上清液经超滤后过Sephadex G-10柱。将经Sephadex G-10柱所得具有阿片活性的粗组分用HPLC-MS分析,根据阿片肽N-端均有一个酪氨酸残基,且在肽链的第三或第四位上有一个芳香族氨基酸残基这一性质,依据分子量确定活性组分中可能存在的所有阿片肽,然后根据这些阿片肽的等电点,利用AKTA Purifier 100快速纯化系统的DEAE-阴离子交换纤维素柱将其进一步分离,活性组分再用Sephasil peptide C18反相高压液相柱分离得到活性组分OP1肽,鉴定纯度后测定其氨基酸组成。最后确定该肽的一级序列为YPFPGPIRYG,该阿片肽序列目前尚未见报道。     

人凝血酶原复合物生产过程中凝血因子活化分析

目的通过比较以组分Ⅲ沉淀和血浆为原料制备人凝血酶原复合物(Prothrombin complex concentrates,PCC)过程中凝血因子活化情况,为选择最适PCC制备原料提供数据支持。方法分别对以组分Ⅲ沉淀和血浆为原料制备PCC过程中中间品的活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目进行检定,分析凝血因子的活化情况。观察以组分Ⅲ沉淀为原料制备PCC过程中添加肝素能否抑制PCC中凝血因子的活化。结果以组分Ⅲ沉淀为原料制备的PCC中间品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目均不合格。以组分Ⅲ沉淀为原料制备PCC生产过程中添加肝素后,PCC中间品的活化的凝血因子活性和人凝血酶活性均不合格。以血浆为原料制备的PCC中间品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性两个项目均合格。结论组分Ⅲ沉淀为原料制备PCC会增加凝血因子活化的风险,新鲜冰冻血浆可作为制备PCC的原料。     

申克孢子丝菌Pall和Pall样蛋白生物信息学分析

为初步了解申克孢子丝菌Sporothrix schenckii基因组中真菌特有蛋白PalI和PalI样蛋白的生物学特征,利用在线生物信息学分析软件,对两蛋白理化特征、功能域、二级结构、抗原表位等进行分析预测。发现两蛋白理论分子量分别为24.6kDa和75.6kDa,等电点均偏碱性; 属于同一蛋白家族,具有相同的功能域和多个PKC磷酸化位点; 两蛋白在近氨基端区域相似度较高,并与其他模式真菌中同源蛋白有很高相似度; 同时,两蛋白都有跨膜区,氨基端序列三级结构极为相似,并有丰富的抗原表位。通过生物信息学分析对申克孢子丝菌PalI和PalI样蛋白生物学特征有了初步的认识,为后续实验研究提供有力支持。     

酵母系统表达TPO与E.coli表达TPO N端结构域生物半衰期比较

为了探讨血小板生成素（ＴＰＯ）糖基化与其生物半衰期的关系,首先纯化了巴氏毕赤酵母系统分泌表达的人ＴＰＯ成熟肽和大肠杆菌表达的人ＴＰＯＮ端结构域蛋白．纯化产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定和活性分析后,两种蛋白以相同浓度或相同活性单位给Ｗｉｓｔｅｒ大鼠尾静脉注射,利用酶联免疫分析（ＥＬＩＳＡ）和ＴＦ１细胞测定不同时间点实验动物血浆中ＴＰＯ浓度或生物学活性,求出两种ＴＰＯ的生物半衰期（ｔ１／２）值．结果显示,以相同浓度和相同活性单位给药,ＴＰＯ成熟肽的ｔ１／２均比其Ｎ端结构域的长,前者分别是后者的１．６５倍和１．２７倍．     

3种人肿瘤坏死因子衍生物的研制

本文在详细分析肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）结构的基础上应用ＰＣＲ技术和基因工程手段改造人ＴＮＦ分子,构建了３种人ＴＮＦ的衍生物。３种人ＴＮＦ衍生物是;Ｎ端缺失７个氨基酸且８、９、１０位的ＰｒｏＳｅｒＡｓｐ改为ＡｒｇＬｙｓＡｒｇ的ＴＮＦ（简写为ｈＴＮＦＤ１）：Ｃ端１５７位Ｌｅｕ改为Ｐｈｅ的ＴＮＦ（简写为ｈＴＮＦＤ２）;Ｎ端和Ｃ端同时作上述改变的ＴＮＦ（简写为ｈＴＮＦＤ３）。这３种衍生物在大肠杆菌中均获得较高表述,它们对Ｌ９２９细胞的细胞毒活性较重组天然人ＴＮＦ有很大升高,尤其是ｈＴＮＦＤ１和ｈＴＮＦＤ３,升高达３个数量级。文中对３种衍生物活性升高的原因作了分析。     

甘薯和花生胰蛋白酶抑制剂的初步研究

许多植物蛋白制成品均含有抑制动物消化的蛋白酶抑制剂。目前已从某些豆类及蔬菜种子中分离出多种对胰蛋白酶具有抑制作用的活性物质。该实验以花生、甘薯等为原料,通过DEAE-Sepharose4BFF阴离子交换柱层析分离胰蛋白酶抑制剂,以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物测定其对胰蛋白酶的抑制活性;将具有抑制活性的组分通过SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量(Mr);以聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质等电点(pI)。结果显示,甘薯中至少有4种胰蛋白酶抑制剂组分,相对分子质量为20～25kD、等电点在pH5.0～6.6之间;花生中至少有三种胰蛋白酶抑制剂组分,相对分子质量为30～70kD、等电点在pH5.0～5.8之间。     

羊驼催乳素基因cDNA克隆及序列分析

实验通过克隆分析羊驼催乳素基因的部分序列,对羊驼催乳素基因的结构和功能进行初步探索和揭示。从GeneBank中已报到的脊椎动物催乳素基因保守区设计一对引物,采用Trizol法提取羊驼胎盘总RNA,利用RT-PCR技术扩增出长度约为510 bp的片断。测序后在NCB I工作平台中进行BLASTn同源性比较,得出结论:羊驼催乳素基因与已登录的哺乳动物催乳素基因同源性均超过85%,最高达97%。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图,并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。。     

人血小板生成素（hTPO）的cDNA克隆,序列测定及其在COS—7细胞中的表达

本文利用反转录ＰＣＲ技术从人胎肝ｍＲＮＡ中分别扩增出ｈＴＰＯ　Ｎ－端和Ｃ－端两个ｃＤＮＡ片段,然后经酶切分别连接重组到质粒ｐＵＣ１９中进行序列分析,在确证其序列与国外文献报道完全一致的基础上,酶切、回收、连接其Ｎ－端、Ｃ端ｃＤＮＡ,并以此为模板,用ＰＣＲ法扩增出全长ＴＰＯｃＤＮＡ片段,并将其重组到穿梭质粒ｐＳＶＫ３中,在ＣＯＳ－７中进行了瞬时表达并检测出表达产物的活性     

玉米精细胞质膜68kD特异糖蛋白组分的纯化和N—端序列测定

经ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ和ＩＥＦ＿ＳＤＳ双向电泳，从玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）精细胞质膜分离纯化得到等电点（ｐＩ）为５．５的６８ｋＤ糖蛋白的单一组分。伴刀豆球蛋白＿辣根过氧化物酶（ＣｏｎＡ＿ＨＲＰ）染色结果表明，该组分的糖链中含有甘露糖及葡萄糖残基。氨基酸序列分析表明，该组分的Ｎ＿端１５个氨基酸序列与ＣｏｎＡ的Ｎ＿端相应序列相同。根据分子量及ｐＩ值的差异，认为该组分并非ＣｏｎＡ，而可能与玉米精细胞质膜上的ＣｏｎＡ受体有关。它在玉米的精卵识别、粘附及融合中有何作用，无疑是令人感兴趣的问题。     

雄性不育水稻农垦58S的P61蛋白质是叶绿体ATP酶β亚基的同工型

Ｐ６１蛋白质是从水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）雄性不育突变体农垦５８Ｓ（ＮＫ５８Ｓ）叶绿体中发现的一个蛋白质,微序列分析结果表明它的Ｎ端氨基酸序列与水稻和大麦叶绿体ＡＴＰ酶β亚基的一致。免疫印迹分析证明Ｐ６１与玉米叶绿体ＡＴＰ酶β亚基抗体有特异性的交叉反应。Ｐ６１与常规水稻“农垦５８”（ＮＫ５８）的β亚基的分子量基本相同,但其等电点偏碱性端,与β相差约０．３个ｐＨ     

虎纹捕鸟蛛粗毒双向凝胶电泳分析及部分蛋白质点的N端序列测定

采用固相 p H梯度等电点聚焦 - SDS双向聚丙烯酰胺凝胶电泳对虎纹捕鸟蛛粗毒进行了分析 ,通过考马斯亮蓝与银染法显色 ,电脑软件识别出约 30 0个蛋白质点 .约有 35个含量较高的蛋白质点分布在分子量 1 0 k D以下区域 ,通过印迹法将凝胶上蛋白质点转移到 PVDF膜上以后 ,对上述分子量 1 0 k D以下的组分进行了 N端序列测定 ,鉴定到了虎纹捕鸟蛛毒素 HWTX- ,HWTX- ,HWTX- 和 SHL- 1在凝胶上的位置 ,同时发现了 5种新的肽类毒素组分 .     

一种热稳定的人胎盘源促细胞生长因子

胎盘细胞中含有丰富的生物学活性物质.通过在 90℃温度下酸性介质抽提、乙醇沉淀、DE-52阴离子交换层析、高效液相色谱层析,从人胎盘组织中分离纯化得到一种热稳定的小分子量促细胞生长因子.该物质对人羊膜细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠骨髓瘤细胞等多种细胞有较高的刺激生长活性.这种物质被称为人胎盘源促细胞生长因子Ⅰ(Human Placental Growth Factor-I,简称HPGF-1),它是一种分子量为1900的肽类物质,是由一条含有10个氨基酸残基的肽链和非肽部分组成的化合物.肽链部分的分子量为1195,其氨基酸组成已被测定,N-末端残基为 Phe.非肽部分的分子量为692. 该因子的等电点为6.8.     

蕲蛇蛇毒中一种新型金属蛋白酶AA-MP-I的纯化和表征

本研究通过嗜硫色谱、Sephadex G-75、蓝胶和POROS HQ20离子交换色谱,从蕲蛇蛇毒中分离得到一种新组分AA-MP-I。该酶为分子量22.9kDa的单体蛋白,等电点为5.55,不含中性糖基,N端序列为STE-FQRYMEIVIVVDHSMVK,结果表明其为新型P-I型金属蛋白酶,对温度敏感,具有抗凝血活性,40℃下抗凝血活性最强,具有出血毒性,无磷脂酶A2活性。     

枯草芽孢杆菌B-332产抗稻瘟病菌的活性物质分析

枯草芽孢杆菌B-332能够产生具有稻瘟病菌拮抗活性的物质。通过等电点法提取该抗菌液粗提物,并利用高效液相色谱-质联用仪对粗提物进行分离纯化,共得到5个组分,它们的质荷比(m/z)分别为1 045.0、1 057.8、1 072.3、1 017.5和1 031.1,是Bacillomycin D(C14-C17)的同系物(质荷比(m/z)为1 017.5的除外),它们结构间相差1个或几个-CH2-基团;各组分均对稻瘟病菌有抑制作用,其中质荷比(m/z)为1 045.0、1 057.8、1 072.3组分的抑菌效果最强。致畸作用试验表明,这3种组分的致畸作用均为使稻瘟病菌的附着孢膨大破裂,与B-332菌株的致畸作用相同,证实了这3种组分是B-332菌株产生具有抑制稻瘟病菌作用的主要活性成分。     

人早期胎盘绒毛纤维连接蛋白的分离纯化及鉴定

人妊娠５－８周的胎盘绒毛经匀浆后,用２ｍｏ１／Ｌｕｒｅａ－ＰＢＳ提取,通过Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱层析,再经ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ凝胶过滤层析,得到人早期胎盘纤维连接蛋白（ｅａｒｌｙｐｌａｃｅｎｔａｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ,ｅｐＦＮ）。经还原及非还原ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫印迹电泳分析,ｅｐＦＮ分子量约５００ｋＤ,是由两个２５０ｋＤ亚基组成,与人足月胎盘纤维连接蛋白（ｔｅｒｍｐｌａｃｅｎｔａｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ,简称ｔｐＦＮ）相似,而大于人血浆纤维连接蛋白（ｐｌａｓｍａｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ,ｐＦＮ）。ｅｐＦＮ与抗人ｐＦＮ抗体及抗人羊水纤维连接蛋白（ａｍｎｉｏｔｉｃｆｌｕｉｄｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ,简称ａｍＦＮ）的三个主要功能区单抗均可发生反应。与五种植物凝集素结合力实验表明,ｅｐＦＮ在糖基组成上与ｐＦＮ和ｔｐＦＮ均不相同。