抗纤维蛋白β链N端七肽抗体的制备

编码纤维蛋白β链Ｎ末端七肽（β七肽）的寡核苷酸片段,通过基因重组技术插入到金葡核酸酶（Ｐ－１蛋白）基因的５′端。在Ｐ_ＲＰ_Ｌ启动子的调控下,β七肽以融合蛋白（β七肽·Ｐ－１）的形式在Ｅ．ｃｏｌｆｉ细胞中得到高效表达。以纯化的融合蛋白为免疫原,制备出抗β七肽抗体;纤维蛋白原（ＦＧ,４ｇ／Ｌ抑制实验证明,该抗体对纤维蛋白（ＦＰ）有特异性反应。     

羧基末端亚单位肽疫苗KLH—Aβ24-42诱导正常BALB／c小鼠制备抗Aβ42抗体

目的：探讨亚单位肽疫苗KLH—Aβ24-42接种小鼠后特异性抗Aβ42抗体的产生情况。方法：将Aβ24-42羧基端与载体蛋白KLH结合制成亚单位肽疫苗免疫BALB／c小鼠。间接ELISA法检测其血清和脑匀浆上清液中的抗体滴度,HE染色对小鼠脑、肝、脾、心、肺和肾行形态学观察抗体毒性。结果：第2次接种后各实验组开始有血清抗体产生,抗体滴度随接种次数的增多而增高;但脑匀浆上清液中未检测到抗体;小鼠各主要脏器均未见病理性变化。结论：亚单位肽疫苗KLH—Aβ24-42免疫BALB／c小鼠后能产生抗Aβ42抗体,观察未见抗体对各重要脏器的毒性病理。     

在肽库中筛选抗磷脂抗体的小肽抑制剂

β２糖蛋白Ⅰ（ｂｅｔａ－２－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ⅰ,β２ＧＰＩ）是一分子量为５０ ｋＤ的糖蛋白．从抗磷脂抗体综合症（Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｙｎｄｒｏｍ ,ＡＰＳ）患者身上获得的抗体可直接与β２ＧＰＩ作用．以β２ＧＰＩ为目标分子,在噬菌体十五肽库中筛选抗β２糖蛋白Ⅰ抗体的小肽抑制剂．通过四轮亲和性筛选,噬菌体的回收率从１．２６×１０－ ４％ 增加到３．１９×１０－ ２％ ．随机挑取噬菌体克隆测定其与β２ＧＰＩ的结合活性及其对β２ＧＰＩ与自身抗体结合的抑制活性,其中部分噬菌体克隆表现出４０％ 的抑制活性．经ＤＮＡ 序列测定,得到一组相关序列．该结果为研究β２ＧＰＩ的抗原表位奠定了良好的基础．     

血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶融合基因在大肠杆菌中的表达

人工合成了血纤蛋白粘附肽基因,构建了粘附肽与低分子量单链尿激酶cDNA的融合基因,在大肠杆菌中表达了融合基因。融合基因表达产物的抗原性和天然尿激酶相同,并具有尿激酶的溶纤活性和粘附肽的抗纤维蛋白单体聚合的功能。     

去B链羧端七肽人胰岛素的分离纯化及性质研究

在大肠杆菌温度诱导体系中以非融合方式进行去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原基因的表达,获得去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原,表达产物占细胞总蛋白量的１３％,表达产物经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离及胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ的酶促转化等步骤,可得到纯度达９４％以上的去Ｂ链羧端七肽人胰岛素,其氨基酸组成与预期值相符,受体活性是标准猪胰岛素的１％．     

β淀粉样蛋白人源性抗体的制备

目的:应用噬菌体展示及抗体库技术,制备并鉴定β淀粉样蛋白(Aβ)人源性抗体。方法:应用固相筛选方法,以人工合成的Aβ1-15肽为靶标分子,在大容量全合成人源性噬菌体抗体库中筛选抗Aβ人源性抗体,并进行特异性鉴定。结果:经过3轮筛选,单克隆鉴定获得噬菌体抗体F11,竞争性ELISA表明抗体对Aβ1-42的结合位点位于1～15氨基酸残基内,ELISA结果证实抗体特异性良好。结论:以Aβ1-15肽为靶标分子获得了特异性良好的人源性抗体。     

血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶融合产物活性分析

人工合成了血纤蛋白粘附肽基因,构建了粘附肽与低分子量单链尿激酶ｃＤＮＡ的融合基因,在大肠杆菌中表达了融合基因。融合基因表达产物的抗原性和天然尿激酶相同,并具有尿激酶的溶纤活性和粘附肽的抗纤维蛋白单体聚合的功能。     

抗人整合素αvβ3-组织因子融合蛋白基因的构建和表达

目的:利用基因工程技术构建和表达抗人整合素αvβ3单链抗体(scFv)与人可溶性组织因子(sTF)的融合蛋白scFv-sTF。方法:用重叠延伸PCR技术扩增scFv基因,同时用组装PCR方法人工合成sTF基因,然后以酶切连接方式融合2个基因,并克隆至原核表达载体pQE80L中,构建表达质粒pQE80L-scFv-sTF,以重组子转化大肠杆菌M15诱导目的基因表达。结果:SDS-PAGE分析显示工程菌可以表达相对分子质量约55×103的融合蛋白scFv-sTF,Western印迹分析证实表达的目的蛋白具有6×His标签;经低剂量IPTG诱导和较低温度培养,scFv-sTF获得了可溶性表达;纯化回收目的蛋白,ELISA试验证实,该重组抗体分子具有良好的抗原结合活性。结论:构建并表达了抗人整合素αvβ3的单链抗体融合蛋白scFv-sTF,并验证了其抗原结合活性,初步证明它可以与抗原特异性结合,为进一步研究其抗肿瘤作用打下了基础。     

从噬菌体抗体库中淘选血纤维蛋白特异的单链抗体

为构建小鼠噬菌体抗体库 ,以获得对人血纤维蛋白特异的抗体 ,由小鼠脾脏提取 m RNA,经反转录 PCR扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段 ,将二者和一段编码十五肽 (Gly4 Ser) 3的 DNA接头借助重组 PCR组装成为单链抗体 (single- chain antibody,Sc Ab)基因 .将单链抗体基因插入噬菌体展示载体 p CANTAB- 5E,通过电击法转化大肠杆菌 TG1细胞 ,用辅助噬菌体 M1 3K0 7超感染 ,构建了库容量在 1 0 8以上的噬菌体单链抗体库 .利用亲和选择方法 (淘选 ) ,从噬菌体抗体库中选得血纤维蛋白特异的单链抗体 .模拟抗体成熟过程 ,用 DNA改组 (DNA shuffling)技术使抗体基因重新组合 ,构建新的改组抗体库 ,并从中选择到提高了亲和力的噬菌体单链抗体 .抗体基因在大肠杆菌中表达 ,表达蛋白经 Sephadex G- 75柱层析分离 ,得到初步纯化的单链抗体蛋白 .     

两种人源化单链抗体-尿激酶融合基因的构建与表达

Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ是单链尿激酶 (Ｓｃｕ ＰＡ)分子的Ｎ端肽段被水解后的产物 ,其分子量小但具有与Ｓｃｕ ＰＡ相同的体内外生物活性[1] 。在过去的工作中 ,本实验室利用噬菌体表面呈现技术筛选到 1株对人纤维蛋白特异的鼠源单链抗体[2 ] ,并构建了鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体—Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ融合基因。为解决该融合基因在大肠杆菌中的高表达问题 ,通过在大肠杆菌中表达构建的一系列融合基因的缺失突变体 ,初步认定Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ基因中两个连排的大肠杆菌稀有密码子ＡＧＧ(精氨酸 )是影响该融合基因表达的主要因素。用ＰＣＲ定位诱变法…     

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达系统的构建

霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）是良好的免疫佐剂和载体蛋白。本研究通过定点突变,在ＣＴＢ基因（ｃｔｘＢ）３′端终止密码前引入了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ,构建了质粒ｐＭＣ０５。ｐＭＣ０５中ＣＴＢ与下游ｌａｃＺ′基因阅读框架相同,转化大肠杆菌后能够表达ＣＴＢ与β－半乳糖苷酶α肽的融合蛋白;所表达的融合蛋白能与ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持ＣＴＢ的基本高级结构和生物学活性;融合蛋白能与抗－ＣＴＢ抗体结合,说明融合蛋白具有ＣＴＢ的抗原性。以上结果表明：通过将外源抗原决定簇基因融合至ｃｔｘＢ的３′端,在大肠杆菌中表达融合蛋白,构建基因工程肽苗是可行的。还探索了转录终止序列对融合基因蛋白表达水平的影响,构建了高效表达融合蛋白的载体－宿主系统。     

重组单链抗体-低分子质量尿激酶融合蛋白在 CHO 细胞中的抗降解研究

抗人纤维蛋白单链抗体-低分子质量尿激酶(Ⅱn-UK)融合蛋白,兼有单链抗体对纤维蛋白的亲和性和尿激酶的溶栓活性,有望开发成为新型导向溶栓药物.但基于通用连接肽(G4S)3的Ⅱn-linker-UK融合蛋白在CHO细胞中表达时出现明显的降解.为了解决此问题,利用分子生物学方法,对Hn-UK融合蛋白进行了分子改造,包括置换连接肽,改变两个半分子(moiety)的相对位置,以及对连接肽附近明确的蛋白酶位点进行突变等方法,并分别研究了改造后的11种Ⅱn-1inker-UK或UK-linker-Ⅱn突变体在CHO细胞中分泌性表达时的稳定性,最终筛选到一种抗降解的突变体.     

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达系统的构建

霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）是良好的免疫佐剂和载体蛋白。本研究通过定点突变,在ＣＴＢ基因（ｃｔｘＢ）３＇端终止密码前引入了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ,构建了质粒ＰＭＣ０５,ＰＭＣ０５中ＣＴＢ与下游ｌａｃＺ＇基因阅读框架相同,转化大肠杆菌后能够表达ＣＴＢ与β－半乳糖苷酶α肽的融合蛋白;所表达的融合蛋白能与ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持ＣＴＢ的基本高级结构和生物学活性;融合蛋白能与抗－ＣＴＢ抗体结合,说明融合蛋     

单克隆非特异性抑制因子-β(MNSFβ)在大肠杆菌中的表达、抗体的制备及在小鼠子宫内膜上的组织定位

为了获得足够量的单克隆非特异性抑制因子-β蛋白(monoclonal nonspecific supressor factor β,MNSFβ)及其抗体用于探讨MNSFβ在着床中的作用机理,本研究构建了表达质粒pBV220/MNSFβ-hCGβ,在大肠杆菌中表达了融合蛋白MNSFβ-hCGβ,用抗hCGβ抗体对表达产物进行鉴定,结果表明融合蛋白MNSFβ-hCGβ得到了正确表达,且分子量和理论值相近。表达产物MNSFβ-hCGβ经初步纯化后用于免疫Balb/C小鼠,制备抗体。同时,我们还构建了表达质粒pGEX-4T-2/MNSFβ,在大肠杆菌中表达了融合蛋白GST-MNSFβ。用融合蛋白GST-MNSFβ对融合前的免疫小鼠回忆刺激并进行检测,制备了抗MNSFβ多克隆抗体和单克隆抗体。应用所制备的多克隆抗体进行免疫组化研究,对MNSFβ在小鼠子宫内膜上进行了组织定位,结果显示,MNSFβ在着床日(受精后第4.5天)小鼠子宫非着床位点的表达和着床位点相比明显提高。     

大黄鱼肌肉生长抑制素-1前肽原核表达、多克隆抗体制备和功能验证

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)在动物肌肉的生长和发育过程中起着重要作用。该研究通过RT-PCR从大黄鱼(Larimichthys crocea)肌肉组织中克隆肌肉生长抑制素-1前肽基因(MSTN-1pros),构建了表达大黄鱼生长抑制素前肽的重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,获得了大黄鱼MSTN-1pros融合蛋白。用分离的重组蛋白免疫大白兔,制备了抗大黄鱼MSTN-1pros的多克隆抗体。经蛋白免疫印迹法检测,确定获得的抗体具有较高的特异性。通过对大黄鱼幼鱼的注射实验,发现注射过MSTN-1pros抗体的大黄鱼增重率比对照组降低了20.71%(P0.05),证明MSTN前肽抗体对大黄鱼的生长具有抑制作用。实验结果表明,MSTN前肽蛋白可以用于养殖鱼类的生长调控。     

新城疫病毒囊膜糖蛋白七肽重复区的融合作用

在新城疫病毒（Newcastle diseasevirus,NDV）膜融合的过程中融合糖蛋白（Fusion protein,F）的两段七肽重复区（Heptad repeat,HR）发挥着重要作用。这两段七肽重复区能够形成反相平行的六螺旋束结构,这被认为是融合蛋白融合后构象的核心结构。对融合作用的深入系统研究将有助于膜融合病毒的防控。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶杂合基因的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

采用 DNA重组技术构建了表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶融合基因的真核表达载体。通过磷酸钙共沉淀法 ,将该表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株 ( CHO- dhfr-)中 ,利用选择培养基筛选出稳定表达的细胞株 ,溶解圈法测定融合蛋白的表达水平为每 1 0 6细胞每天 5 8IU。该融合蛋白保留了与纤维蛋白的结合活性和溶解纤维蛋白的溶纤活性。SDS- PAGE,Western印迹法分析证明融合蛋白的相对分子质量约为 70× 1 0 3     

β淀粉样肽单克隆抗体可变区基因的5′RACE扩增及序列分析

目的:克隆并分析抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因。方法:从分泌抗β淀粉样肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株A8中提取总RNA,根据恒定区序列设计基因特异性引物,通过5′RACE法扩增抗体的轻链和重链可变区基因,测定并分析可变区基因序列,并克隆入pMD18-T载体。结果:重链可变区基因序列全长450bp,编码150个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长429bp,编码143个氨基酸残基。在GeneBank中对氨基酸序列进行比对分析,二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。根据Kabat法则对A8抗体轻链和重链可变区氨基酸序列基因进行分析并确定了3个抗原互补决定区(CDR)、4个框架区(FR)和信号肽。结论:通过5′RACE法得到了抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构,以及对该抗体进行人源化改造奠定了基础。     

一种可识别神经元特异微管蛋白的抗体

通过人工合成大鼠巢蛋白Ｃ－末端的一段２０肽,制备得到了抗巢蛋白的抗体－Ａｎｔｉ－Ｎｅｓ－２。我们发现该抗体除了能识别小鼠２４０ｋＤ的巢蛋白条带外,还特异性识别另一分子量约为５０ｋＤ的蛋白条带,蛋白印迹反应提示,该５０ｋＤ蛋白可能与神经细胞的增殖和分化相关。经分离纯化和Ｎ－端氨基酸序隐测定证实：该５０ｋＤ蛋白为微管蛋白。     

人受精蛋白β整联蛋白配体区cDNA的克隆、表达及抗体制备

从人睾丸中抽提mRNA,合成双链cDNA,利用合成的PCR引物扩增受精蛋白β（fertilinβ）的整联蛋白配体区cDNA（hf279)。序列分析表明,该区编码93个氨基酸,与文献报道安全相同。将hf29插入质粒pGEX－4T－2,构建pGEX-hf279表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,表达菌株经IPTG诱导,可产生大量可溶性的表达蛋白GST－HF93。SDS－PAGE分析表明融合蛋白表观分子量为38kD,其含量占菌体可溶性蛋白的50％以上。表达产物经谷胱甘肽转硫酶（GST）亲和层析柱纯化,得到90％以上纯度的凳晤蛋白。融合蛋白经凝血酶切2h可得HF93肽。再经GST新和层析柱去除GST,得到纯度大于80％的HF93肽。将其和SDS－PAGE凝胶上切下的HF03多肽条带一起用于免疫BALB／c小鼠,经ELISA检测,证明获得了较高滴度的抗体。