一些理化因子对α淀粉酶构象与活力的影响

用荧光光谱,紫外差示光谱和ＣＤ谱研究了一些理化因子对枯草芽孢杆菌８６３１５α淀粉酶的构象与活力的影响,实验表明,酸变性和碱变性所引起的酶构象变化是不同的;乙醇不降低α淀粉酶活力,但使其构象发生较大变化,α螺旋度从天然酶的２６,１％降到２１．８％,其构象变化不引起活性中心的改变;酶在７０℃处理１０ｍｉｎ后,由原来紧密构象变为松散构象,α螺旋度从２６．１％降到９．０％,酶活性完全丧失;而在０．０２ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ_２和０．０２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的共同存在下,７０℃处理１０ｍｉｎ,酶活性不变,其荧光光谱和ＣＤ谱接近于天然酶,所以,ＣａＣ_ｌ２和ＮａＣｌ能保护α淀粉酶的构象,使之不受热变性。     

淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶在盐酸胍和碳酸胍变性过程中的构象变化

 利用紫外差光谱,荧光光谱和圆二色谱法对比地研究了淀粉液化茅孢杆菌α-淀粉酶在盐酸胍和碳酸胍变性过程的构象变化与活性关系以及在变性早期钙离子对酶构象的稳定作用。     

黄原胶对α-淀粉酶耐热性及其在热变性过程中构象变化的影响

黄原胶（ＸＧ）对α－淀粉酶（ＢＦ－７６５８）具有较好的热稳定作用,０．２％黄原胶α－淀粉酶液７５℃处理７分钟残余酶活为２５．８％,而对照酶液几乎完全失活。酶分子立体构象的变化与其相应的生物活力有着一定的联系。加胶酶在相同条件的部分热变性过程中,酶活损失较少,其分子构象的变化程序也较弱。     

盐酸胍对人类胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响

研究人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ,Ｅ．Ｃ．３．１．３．１）在胍变性过程中构象与活力的变化;测定胍存在时酶的表观米氏常数（Ｋｍ）。结果表明,低浓度的盐酸胍（＜０．５ｍｏｌ／Ｌ）使变性平衡态酶的发射荧光强度略有下降,酶活力增强;随盐酸胍浓度的增加,其荧光强度不仅不再下降,反而升高,酶逐渐失活;当盐酸胍浓度为１．５ｍｏｌ／Ｌ时,其荧光光谱的最大峰位红移,酶活力迅速下降;当盐酸胍浓度为３ｍｏｌ／Ｌ时,峰位由３３３．５ｎｍ红移至３５７．１ｎｍ,此时酶活力丧失;当盐酸胍浓度为４ｍｏｌ／Ｌ时,峰位不再红移,但其荧光强度继续增加。测得变性初态酶的表观Ｋｍ值随盐酸胍浓度的增加而增大。结果说明,荧光强度的增加和最大发射峰位的红移是该酶变性失活的一个灵敏指标;酶活力的变化明显快于酶分子整体构象的变化;低浓度的盐酸胍微扰了酶活性部位的构象,而对其整体构象无显著影响。提示酶活性部位具有柔性。     

缢蛏碱性磷酸酶胍溶液中分子折叠与活力变化研究

报道了缢蛏碱性磷酸酶（简称ＡＬＰ）经不同浓度盐酸胍处理时酶的分子构象发生的变化以及酶变化和失活的动力学过程。在胍中酶荧光发谢峰强度下降,紫外差光谱在２４６ｎｍ和２８５ｎｍ处出现２个负峰,ＣＤ谱中酶的α螺旋度下降,且随浓度增大,变化程度也加大。动力学研究表明,酶在０．５ｍｏｌ／Ｌ、１．０ｍｏｌ／Ｌ、２．０ｍｏｌ／Ｌ、３．０ｍｏｌ／Ｌ、４．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍中的变性速度常数分别为３．２１×１０＾－４ｓ     

钙调神经磷酸酶在胍变性过程中活力及构象变化的比较

钙调神经磷酸酶（ＣａＮ）在盐酸胍溶液中的内源荧光、远紫外ＣＤ谱及剩余活力的变化提示：ＣａＮ的酶活力在胍浓度为０．５ｍｏｌ／Ｌ左右可完全丧失,同时伴有内源荧光强度的下降,３３３ｎｍ最大发射峰的红移（提示了色氨酸和酪氨酸残基的暴露）。比较不同胍浓度下牛脑ＣａＮ的失活与整体构象变化,表明酶的失活先于整体构象变化。在０．６ｍｏｌ／Ｌ胍溶液中,内源荧光变化的动力学过程只能测出一相,而酶失活的动力学过程为快、慢两相,快相动力学速度常数比整体构象变化速度常数大１－２个数量级,慢相失活速度常数与整体构象变化速度常数相近。提示低浓度胍可引起该酶的完全失活,活性部位的空间构象比整个酶分子的构象更易受到变性剂的扰乱。     

中华猕猴桃蛋白酶在盐酸胍中分子折叠与活力的关系

中华猕猴桃蛋白酶(Actinidin)在盐酸胍溶液中活力变化结果提示:酶在0.1mol/L胍中活力略有升高,随胍浓度增大,活力先经历一个陡降区,在1—2mol/L胍中有个稳定区域,随胍浓度增大,活力继续下降。同时以荧光光谱,圆二色光谱研究该酶分子的构象变化。结果表明引起酶构象发生明显变化所需胍浓度(3mol/L)远比酶明显失活所需胍浓度(0.5mol/L)大。相同胍浓度下酶活力丧失速度快于构象变化速度。经5mol/L胍变性的酶直接稀释至胍浓度为0.05mol/L时,酶活力不能恢复,而构象迅速恢复。失活酶先稀释至胍浓度为1—2mol/L、再进一步稀释至胍浓度为0.05mol/L,活力能恢复50％左右。以上结果表明,相对于整个酶分子来说,活性中心的构象变化对变性剂更敏感。Actinidin的失活及复活过程是多相的复杂过程。     

电荷传递反应可以敏感地考察铜锌超氧化物歧化酶活性部位的构象变化

Fe(CN)₆^4-与铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)间的电荷传递反应发生在酶的活性部位,电荷传递反应的速度和幅度对由变性引起的酶活性部位的构象变化非常敏感.对于所有的变性酶样品,电荷传递反应的速度都不同程度的下降,这与每个样品的活力下降相对应.反应速度的下降反应了酶变性后引起的活性通道构象及其间静电场的破坏.在不同pH条件下变性的酶样品,其电荷传递反应幅度的变化表明,活性部位His残基的静电相互作用对变性过程中活性部位的构象变化可能是重要的.由电荷传递反应参数得到的活性部位构象变化速度与酶的失活速度接近.     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶（ArgRS）及其变种的光谱学研究

本文用吸收光谱、溶剂微扰差光谱荧光光谱和ＣＤ光谱对天然酶ＡｒｇＲＳ及其变种酶ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ和ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的构象进行了研究,结果表明Ｌｙｓ３０６的突变引起变种酶分子表面的生色氨基酸残基所处微环境与天然酶梢有不同,ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ比ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ有更大的构象变化。变种酶ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ与天然酶的构象差别不大。ＣＤ光谱的分析显示转角在变种酶分子中依活力的下降二级结构中所占百分比下降。可以得出结论ＡｒｇＲＳ的Ｌｙｓ３０６所带的正电荷对维系ＡｒｇＲＳ的构象绝对重要,这种酶的构象变化引起变种酶的活力丧失;而ＡｒｇＲＳ的Ｌｙｓ３８１的改变则似乎不能引起酶构象的可觉察的变化。     

氨基酰化酶在LDS溶液中的失活与去折叠的比较研究

氨基酰化酶在阴离子去圬剂十二烷基硫酸锂（ＬＤＳ）溶液中的失活与去折叠的研究结果表明,在低浓度的ＬＤＳ溶液（０．６ｍｍｏｌ／Ｌ）中变性时,以荧光和紫外差吸收方法监测的酶分子构象尚未发生明显变化。而酶的活力已经大部分或几乎全部丧失。当ＬＤＳ浓度达１．６ｍｍｏｌ／Ｌ时,此时酶分子的构象变化才达到最大程度,在实验使用的ＬＤＳ的浓度范围内,用远紫外ＣＤ光谱监测的二级结构没有发生明显的变化。从上述研究结果,可以认为含锌氨基酰化酶的活性部位也具有相对的柔性。     

SNase R在胍变性过程中构象与活力变化的比较

以紫外差光谱、荧光光谱为监测手段对金黄色葡萄球菌核酸酶类似物(SNase R)在胍溶液中构象与活力变化进行了比较.SNase R在Llmol L0.8mol L和0.5mol L胍溶液变性时变性过程均为两个一级反应,但是酶在上述胍浓度下失活的速度远快于构象变化的速度:酶在同一胍浓度下活力丧失的程度也远快于构象变化的程度.上述结果表明:SNase R的活性部位可能位于柔性较大的区域.     

氨基酰化酶在LDS溶液中的失活与去折叠的比较研究

氨基酰化酶在阴离子去污剂十二烷基硫酸溶液中的失活与去折叠的研究结果表明,在低浓度的ＬＤＳ溶液中变性时,以荧光和紫外差吸收方法监测的酶分子构象尚未发生明显变化,而酶的活力已经大部分或几乎全部丧失。当ＬＤＳ浓度达１．６ｍｍｏｌ／Ｌ时,此时酶分子的构象变化才达到最大程度。在实验使用的ＬＤＳ的浓度范围内,用远紫外ＣＤ光谱监测的二级结构没有发生明显的变化。     

鸡肝二氢叶酸还原酶在盐酸胍溶液中构象的序变与激活

用蛋白质内源荧光、疏水荧光探针TNS及蛋白酶K限制性酶解等方法研究了二氢叶酸还原酶在盐酸胍变性过程中的构象变化及动力学,并与活力变化进行了比较.TNS可以监测到与激活同步的构象变化;盐酸胍浓度大于0.75mol/L时,二氢叶酸还原酶被蛋白酶K水解速度增大;当盐酸胍浓度大于1.2mol/L时,才能监测到酶分子整体构象的变化.以上结果表明二氢叶酸还原酶在盐酸胍溶液中的变性并不符合标准的二态模型,而是先经历构象逐步松散的序变过程,然后发生协同的构象伸展.二氢叶酸还原酶在低浓度盐酸胍溶液中的激活是由于酶活性部位构象的微小变化引起的.酶活性部位构象的变化虽然降低了酶与废物的结合能力,但加快了酶促反应限速步骤,即底物解离速度而使酶活力升高.     

鸭肝脂肪酸合成酶的胍变性与失活

报道了鸭肝脂肪酸俣成酶在胍变性过程中构变性过程中构象变化和活性变化的关系,首次验证了邹承鲁提出的酶活性部位构象的理论适用于多功能复合酶,同时该酶变性及复性均可测定出多个阶段,且证明有无活性稳态酶存在,在低浓度盐酸胍溶液中该酶的全反应活性和其中两个还原部位单独活性被同步可逆抑制,随着胍浓度增高,出现不可逆失活且程度和速度均迅速提高,在０．５４ｍｏｌ／Ｌ胍中该酶全反应活性在１．５分种内已有一半不可逆失     

溴化+烷基三甲基铵滴定时氨基酰化酶的失活与构象变化的比较

研究了阳离子去污剂-溴化+烷基三甲基铵变性时氨基酰酶的失活与构象变化.当用溴化+烷基三甲基铵滴定氨基酰化酶时,随着去污剂浓度增大,酶的活力逐渐丧失,至50mmolL时酶完全失活.用荧光发射光谱(295nm激发)的方法监测了氨基酰化酶的构象变化.发现氨基酰化酶失活先于构象变化.从这一结果看来.金属酶的活性部位构象可能也是比整个分子的构象具有较大的柔性或运动性.     

溴化+烷基三甲基铵滴定时氨基酰化酶的失活与构象变化的比较

研究了阳离子去污剂-溴化+烷基三甲基铵变性时氨基酰酶的失活与构象变化.当用溴化+烷基三甲基铵滴定氨基酰化酶时,随着去污剂浓度增大,酶的活力逐渐丧失,至50mmolL时酶完全失活.用荧光发射光谱(295nm激发)的方法监测了氨基酰化酶的构象变化.发现氨基酰化酶失活先于构象变化.从这一结果看来.金属酶的活性部位构象可能也是比整个分子的构象具有较大的柔性或运动性.     

牛脑V型质子转运ATP酶复合体依赖于温度的活性变化

在ＫＣｌ介质中牛脑Ｖ－型质子转运ＡＴＰ酶复合体活力温度的Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ图在３３℃附近呈现明显的折点,同样做其Ｎ－［１－芘］马来酰亚胺（Ｎ－［１－Ｐ］Ｍ）的荧光－温度的Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ图,发现其折点温度也为３３℃,当加入１００μｍｏｌ／ＬＮＥＭ（Ｎ－ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）,ＡＴＰ酶复合体活力部分被抑制后的Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ图折点下降为２７℃,加入０．７５－０．８５ｍｏｌ／Ｌ尿素则活力的Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ图的折点变为３０℃。加入６％（Ｖ／Ｖ）的乙醇后,活力的Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ图的折点上升为３８℃。加入ＮＥＭ,尿素和乙醇的内源荧光和Ｎ－［１－Ｐ］Ｍ标记的荧光测定,表明它们确实引起了牛脑Ｖ－型质子转运复合体构象的改变,这表明引起构象变化配基的加入,可改变牛脑Ｖ－型质子转运ＡＴＰ酶复合体的Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ图折点温度,也说明牛脑Ｖ－型质子转运ＡＴＰ酶复合体Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ图折点与酶复合体的构象直接相关。     

活性部位的柔性

比较酶在变性过程中构象和活力变化,发现在活性完全丧失时尚无可察 觉的整体构象变化。排除变性剂抑制和寡聚酶解聚等可能性之后,提出了酶活性部位柔性假说。随后用多种实验方法直接证实了活性部位的构象变化先于分子整体构象变化,并与活性丧失同步,根据催化过程中活性部位构旬变化,以及限制活性部位构象变化对酶活性的影响,提出了酶活性部位柔性为酶充分表现其催化活性所必需的设想。     

缢蛏碱性磷酸酶胍溶液中分子折叠与活力变化研究

报道了缢蛏碱性磷酸酶（简称ＡＬＰ）经不同浓度盐酸胍处理时酶的分子构象所发生的变化以及酶变化和失活的动力学过程。在胍中酶荧光发射峰强度下降,紫外差光谱在２４６ｎｍ和２８５ｎｍ处出现２个负峰,ＣＤ谱中酶的α螺旋度下降,且随浓度增大,变化程度也加大。动力学研究表明,酶在０．５ｍｏｌ／Ｌ、１．０ｍｏｌ／Ｌ、２．０ｍｏｌ／Ｌ３．０ｍｏｌ／Ｌ、４．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍中的变性速度常数分别为３．２１×１０~（－４）ｓ~（－１）、６．３８×１０~（－４）ｓ~（－１）、２．１７×１０~（－３）ｓ~（－１）、２．３３×１０~（－３）ｓ~９－１）、５．１７×１０~（－３）ｓ~（－１）;而酶在相应盐酸胍中的失活速度常数分别为２．３３×１０~（－４）ｓ~（－１）、３．５７×１０~（－４）ｓ~（－１）、５．８６×１０~（－４）ｓ~（－１）、１．１４×１０~（－３）ｓ~（－１）、３．４５×１０~（－３）ｓ~（－１）;表现为失活与构象伸展变化基本平行。     

胍变性肌酸激酶复性复活过程中构象与活力的比较研究

本文讨论了经3M盐酸胍变性的兔肌肌酸激酶复性和复活的动力学过程,对二者进行了比较,以期从量的关系上研究酶的构象与催化活力之间的关系。从萤光和紫外差吸收光谱的变化看,复性过程基本上是变性过程的逆转。变性肌酸激酶复性遵循一级反应方程,以萤光强度变化为标志的速度常数k=2.2×10~(-3)秒~(-1)。酶复活过程却表明由两个一级反应所组成,其速度常数分别为k_1=0.97×10~(-3)秒~(-1),k_2=0.17×10~(-3)秒~(-1)。可见构象变化速度与复活过程中较快的反应速度相近。这说明在反映色氨酸及酪氨酸微环境的构象变化基本完成之后,活力恢复的过程还没有终结。可以认为兔肌肌酸激酶的构象与活力密切相关,酶的构象完整是催化活力的基础。