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相似文献
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1.
在真核细胞中表达近似于人类天然糖基化的白细胞介素4(hIL-4),为重要的研究课题。利用基因工程技术,以痘苗病毒作为载体,使之在真核细胞中表达hIL-4,为生产糖基化的hIL-4开辟新的可能途径。在痘苗病毒表达载体pJ120质粒的基础上,组建了含有hIL-4基因的pJl20/hIL-4重组质粒,该质粒以痘苗病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因为侧翼序列,中间插入痘苗病毒的P11和P25两个转录方向相反的启动子,P25的下游连接β-半乳糖苷酶(LacZ)基因,hIL-4基因在痘苗病毒启动子P11控制下进行表达,将PJ120/hIL-4质粒DNA用脂质体转染法导入TK阴性的骨髓瘤细胞(TK143细胞),与预先感染的痘苗病毒在细胞内进行同源序列重组,并且用病毒的核酸杂交鉴定证实,hIL-4基因已重组到痘苗病毒基因组中,用hIL-4应答细胞株检测病毒感染细胞上清,发现重组病毒感染的细胞上清中含有高滴度的hIL-4活性,并对此种情况下hIL-4产生的条件进行了动态观察。  相似文献   

2.
刘红兵  张智清 《病毒学报》1998,14(2):109-113
将hGM-CSFcDNA插入含有P11k及25k双向启动子的痘苗病毒载体PJ120的P11K启动子下游,而P25K下游则为LacZ基因,成表达质粒pJ120/GM-CSF。,以此质粒与痘苗病毒天坛株共转染TK-143细胞。在BUdisplay status  相似文献   

3.
人癌胚抗原-重组痘苗病毒的构建和制备   总被引:23,自引:0,他引:23  
痘苗病毒的基因组庞大,结构复杂而特殊,不可能将外源基因直接插入它的基因组,必须利用一种特殊的痘苗病毒质粒,才能构建成功重组痘苗病毒.在分析了痘苗病毒质粒pJ120〔含有我国天花疫苗-痘苗病毒天坛株761的启动子和胸苷激酶(thymidinekinase,简称TK基因),及含有人癌胚抗原(carcinoembrynicantigen,简称CEA)cDNA全序列的质粒p91023B-cea-17结构的基础上,设计出三步法构建了重组疫苗病毒质粒pJ-CEA.经酶切及PCR鉴定pJ-CEA中CEAcD-NA的存在,进一步用同源重组方法构建了表达人CEA的重组痘苗病毒,并以人体成纤维细胞作为宿主细胞,对CEA-重组痘苗病毒进行了大量培养.再次证实痘苗病毒是良好的真核表达载体,可以高效而准确地表达细胞膜糖蛋白CEA.  相似文献   

4.
汉滩病毒A9株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定   总被引:7,自引:0,他引:7  
马章亮  杭长寿 《病毒学报》1998,14(3):221-228
为发展国产化肾综合征出血热(HFRS)病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒A9株M基因片段为目的基因,构建转染质粒pJSBA9M。以携带Lac基因的重组病毒为亲本,使表达载体pJSB-A9M上的M片段与痘苗病毒内的Lac基因重组,将Lac置换成A9M片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经PCR扩增证实A9M片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的Vero E6细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体(HCO2、  相似文献   

5.
从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1-168株)病毒基因组中,分离出含有糖蛋白D(gD)基因的1.2kb片段,插入带有痘苗病毒天坛株TK区的质粒pJSB1175P7.5k启动子下游,转染无白血病鸡胚原代细胞,获得带有HSV-1-168gD基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达HSV-1-168gD糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。在感染细胞中表达的膜抗原经SDS-PAGE分析,表达分子量为54kD糖蛋白。用Southern杂交分析了重组病毒DNA中特异的gD基因,对作为活疫苗的重组痘苗病毒株进行了一些微生物学活性、免疫原性和毒力等方面的研究。  相似文献   

6.
将编码柯萨奇B3病毒(CVB3)衣壳蛋白VP1和VP2的基因,分别克隆到具有7.5k启动子的痘苗病毒表达载体pGJP5上;将CVB3衣壳蛋白全基因克隆到具有T7启动子的痘苗表达载体pTM1上,并筛先到相应的重组痘苗病毒VVP1、VVP2和VVP/4/2/3/1。VVP1和VVP2稳定表达产物为CVB3衣壳蛋白VP1和VP2,而VVP4/2/3/1为一无分泌性的多聚蛋白,且这三种表达产物均属无分泌性  相似文献   

7.
HIV-1外膜(env)基因在重组痘苗病毒中的高效表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
应用重组痘苗病毒作载体,在ATI、P7.5突变型早期启动子控制下,高效表达了(经定点突变去除一处早期终止信号的)HIV-1env基因。经Westernblot证明,晚期启动子活性强的pSFJ2-38能更高效地表达env基因。经Lentil-Lectin提取以及SDS-PAGE后的激光扫描测定结果,在107个感染细胞中可产生50-70μg的Env蛋白。  相似文献   

8.
将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒。体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质闰可表达RNA聚合酶。将PV的5’NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5’NCR质粒;  相似文献   

9.
人白介素6受体功能区片段在E.coli中的表达   总被引:1,自引:1,他引:0  
通过DNA体外重组技术,以pET-3b为表达载体,构建了重组表达质粒pET-6R(B)和PET-6R(B)4,分别编码28kD和hIL-6R配基结合区片段及其53kD的二联体蛋白,并为酶切分析和DNA序列分析所证实,SDS-PAGE分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出28kD的蛋白rIL6R-28和53kD的rIL6R-53重组蛋白分别占菌体总蛋白的45%和29%左右,重组蛋白主要包涵体形  相似文献   

10.
乙肝病毒PreSl片段与乙肝表面抗原羧端的融合表达   总被引:4,自引:0,他引:4  
我们利用聚合酶链反应法(PCR)得到了编码乙肝病毒肝细胞受体结合位点PreSl(21 ̄47)的基因片段,并将它分别融合到S基因中相应于第175,188和223位氨基酸残基处。所得到的融合基因插入痘苗病毒表达载体pGJP-5后,在哺乳动物细胞CV-1中进行了暂时表达,对融合蛋白的表达、分泌和抗原性的研究表明,3种融合基因均能表达具有S和PreSl双重抗原性的融合蛋白,但融合位点对表达水平和分泌性质有  相似文献   

11.
利用PCR方法对单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D(HSV-2gD)基因进行了修饰,在其5'端删去约500bp的非编码区,仅保留ATG上游7个bp。将修饰后的HSV-2gD基因插入到带有痘苗病毒天坛株TK基因区段的痘苗表达质粒pJSA1175,置于痘苗病毒P7.5k早/晚期启动子控制下。将此重组质粒用脂质体Lipofectin方法转染已受野型TK ̄+痘苗病毒天坛株感染的TK ̄-143细胞,通过同源重组机制和标志基因LacZ产物的蓝斑显色作用,以及BudR试剂对TK表型的选择压力,筛选出整合有HSV-2gD基因的重组痘苗病毒。Southem杂交表明,HSV-2gD基因已正确地插入痘苗病毒TK基因区内;间接免疫荧光检测显示,HSV-2gD蛋白已得到有效表达,且主要分布于细胞膜。重组病毒免疫家兔可产生明显的抗HSV-2gD中和抗体。用重组病毒免疫小鼠,3周后可使94%(17/18)的小鼠对抗HSV-2的致死量攻击,表明重组病毒具有明显的免疫保护作用。  相似文献   

12.
通过DNA体外重组技术,以pET-3b为表达载体,构建了重组表达质粒pET-6R(B)和PET-6R(B)4,分别编码28kD的hIL-6R配基结合区片段及其53kD的二联体蛋白,并为酶切分析和DNA序列分析所证实。SDS-PAGE分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出28kD的蛋白rIL6R-28和53kD的rIL6R-53。重组蛋白分别占菌体总蛋白的45%和29%左右。重组蛋白主要以包涵体形式存在,Western印迹表明重组蛋白具有IL-6R的抗原性。  相似文献   

13.
鸡痘病毒载体启动子的优化   总被引:7,自引:0,他引:7  
要提高外源基因在鸡痘病毒(FPV)载体的表达量,必须使用强启动子来控制表达。为构建较强的启动子组合,根据痘苗病毒天然启动子P7.5的结构,人工合成4条寡核苷酸,形成一个早期启动子和一个晚期启动子,其首尾可相互连接。利用分子生物学常用实验方法把合成的启动子进行不同组合,最终形成10个较有代表性的启动子组合PS1 ̄10。在其下游插入大肠杆菌β-半乳糖苷酸基因LacZ,并进一步构建成鸡痘病毒转移载体pF  相似文献   

14.
王自力  梁国栋 《病毒学报》1999,15(2):119-124
利用腺病毒表达系统在肝癌细胞中成功地表达了有生物活性的白细胞介素-12(IL-12)。IL-12的P35和P40 cDNA分别克隆到腺病毒载体pACCMV.pLpA,构建pAC/P35和pAC/P40表面质粒。与腺病毒重组质粒pJM17共转染293细胞,通过基因重组产生IL-12P35和P40重组腺病毒。用重组腺病毒感染肝癌细胞株HepG2和SMMC7721,经ELISA和Western检测证明,  相似文献   

15.
对表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒VVM11KRG株生物学性质进行了研究,该重组病毒的特点是:(1)糖蛋白基因插入到痘苗病毒天坛株基因组HindⅢM片段中;(2)启动子为痘苗病毒天坛株P11晚期启动子;(3)不含外源lac基因。该重组病毒在CV-1细胞和鸡胚细胞上繁殖滴渡略高于另一株重组痘苗病毒VVTK11KRG,在鸡胚细胞中繁殖滴度第三天达到最高,在CV-1细胞中第二天达到最高。温度稳定性与天坛株相比没有明显改变。重组病毒在家兔皮内的毒力比亲本株(天坛株)低。间接免疫荧光和Westernblot都证明了狂犬病毒糖蛋白有良好的表达。通过Southernblot证实糖蛋白基因准确地插入到HindⅢM片段中。重组痘苗病毒启动子与部分糖蛋白基因克隆到pGEM3zf(-)质粒上,对该段DNA序列分析表明不会产生移码和融合蛋白,从而为该重组病毒的使用提供了明确的基因背景资料。  相似文献   

16.
将中国株HIV-1B亚型gp120全基因序列克隆到杆状病毒转座载体pFastBacI中多角体启动子下游,构建成重组转座载体pFastBacI-gp120,利用细菌/杆状病毒(Bac to Bac)表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞Sf9中高效表达了HIV-1的外膜糖蛋白gp120,SDS-PAGE和Western blot分析结果一致,证明表达了2种糖基化程度不同的gp120。  相似文献   

17.
人白细胞介素—2基因在人骨肉瘤细胞系内表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
从pHIG53质粒内切下人白细胞介素-2cDNA基因,并经中间一pSP72转换成与pDOR-neo载体相区域的酶切位点,然后将IL-2cDNA定向连接入pDOR-neo载体,构建成功人IL-2逆转录病毒载体,经脂质体民入人骨肉瘤细胞系Ma中,经G418筛选后测转基因肿瘤细胞培养上清中IL-2表达量,每1×10^5细胞24hIL-2表达量为50-800U,为骨肉瘤的基因治疗创造条件。  相似文献   

18.
体外研究汉滩病毒(HTNV)S基因及其5'端表达的意义,为核蛋 白T细胞表位的研究奠定基础。设计2套引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出S 基因全读码框(37-1326bp)及S基因5'端(37-501bp),用TA克隆将其克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,成功构建pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体,并通过脂质体转 染至Vero细胞中,进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N在Vero细胞中的表达。pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体有较高的转染效率,目 的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究HTNV-S基因在T细胞表位研究中的意义。  相似文献   

19.
崔虹  尚大庄 《病毒学报》1997,13(3):193-201
从我国分离到的一株单纯疱疹病毒I型病毒基因组中,分离出含有糖蛋白D基因的1.2kb片估,插入带有痘苗病毒天坛株TK区的持粒pJSB1175P7.5k启动子下游,转染无白血病鸡胚原供细胞,获得带有HSV-1-168gD基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达HSV-1-168gD糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。  相似文献   

20.
制备CVB3结构蛋白和非结构蛋白重组质粒DNA疫苗时,采用RT-PCR从CVB感染的HeLa细胞中扩增VP1、VP2、2A和3D基因,重组入真核表达质粒pcDNA3中,构建pcDNA3/VP2、pcDNA3/VP1、pcDNA3/2A和pcDNA3/3D重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞COS-7,用RT-PCR检测mRNA的转录,用Western-blot检测表达产物。结果4种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为CVB3相应序列,Western-blot证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建CVB3结构与非结构蛋白的重组质粒DNA疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。  相似文献   

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