人乳头瘤病毒6b型晚期蛋白L_2免疫反应表位的确定

人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）含有２个晚期开放读码框（ＯＲＦ）,Ｌ＿２ＯＲＦ编码的蛋白具有型特异性。本研究用能表达产生完整ＨＰＶ６ｂＬ＿２蛋白的质粒ｐ６ｂＬ＿２ＮＸ,采取核酸外切酶Ⅲ定向连续次级克隆的方法,制备了一系列一端逐渐删切的ＤＮＡ片段,诱生一组从Ｃ端至Ｎ瑞依次减少的Ｌ＿２蛋白与相应血清作免疫印迹实验,最小的仍保持阳性反应的多肽即含有抗原表位,实验结果ＨＰＶ６ｂＬ＿２蛋白的核酸编码区位于５４８１－５５０６之间,其相应氨基酸序列是ＥＰＧＩＮＰＴＱ。     

人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆及蛋白表达

目的：在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型（HPV6）L1的融合蛋白。方法：PCR方法扩增HPV6 L1,基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6mLI,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果：酶切和测序结果证实HPV6 mL1基因的原核表达载体构建正确;以1mmol／L IPTG于37℃诱导4h,蛋白以包涵体形式表达;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为80000。结论：获得大肠杆菌表达的HPV6L1蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供了基础。     

人乳头瘤病毒16型L1和L2晚期蛋白在原核细胞中的表达

目的　HPV的某些型别尤其是HPV16 ,18型感染与宫颈癌的发生有密切的关系。宫颈癌在全球妇女癌症死亡原因中居第二位。在发展中国家 ,宫颈癌在妇女癌症死因中列第一位。尽管早期宫颈癌患者放疗及手术治疗效果较好 ,但对中晚期宫颈癌患者治疗效果却很差。因而 ,采取有效的措施预防HPV感染对于宫颈癌防治工作无疑是非常必要的。在对乳头瘤病毒结构和功能的研究中发现 ,以L1和L2为保护性抗原构建的疫苗株很可能在预防HPV感染及其引起的恶性肿瘤方面发挥重要作用。目前国际上常通过原核和真核表达系统获得L1和L2蛋白。本实验拟通过原核表…     

中国人乳头瘤病毒6型L1、L2表达及产物自动装配成病毒样颗粒

为研究我国人乳头瘤病毒 6型 (HPV 6 )基因组晚期区序列变异及衣壳蛋白装配特性 ,从中国尖锐湿疣患者病损组织克隆了HPV 6L1和L2序列 ,经测序、拼接 ,获得HPV 6基因组晚期区序列。获得的两条长 2 86 9bp的序列 (GenBank登录号为AY0 15 0 0 6和AY0 15 0 0 8) ,属于HPV 6b亚型 ,与原型序列比较 ,在L1和L2ORF中共有 9个核苷酸变异 ,其中错义突变 4个。将L1和L2分别重组到杆状病毒 (AcNPV)表达载体 ,在Sf9细胞中探讨L1和L2的表达及装配规律。当L1和L2分别表达于Sf9细胞时 ,L1可以在细胞核中装配成病毒样颗粒 (VLP) ,而L2不能。从L1重组杆状病毒单独感染和L1、L2重组杆状病毒同时感染的细胞分别纯化VLP ,获得L1 VLP和L1 L2 VLP。二者在大小及形态上无明显差异 ,直径约 5 0nm ,与真实的病毒粒子相似。L1 L2 VLP包含摩尔比例约为 4∶1的L1和L2 ,具有HPV 6L1VLP构象表位。当用不同比例重组病毒同时感染细胞时 ,一定水平的L2表达可以使L1表达量及VLP产量提高。HPV 6基因组晚期区序列变异率 <0 .2 8% ,70 81位的A→G和 70 99位的G→A两处突变在我国HPV 6分离物中具有代表性。克隆的HPV 6L1和L2序列可以用于表达 ,表达产物 (L1或L1 L2 )可以自发装配成VLP。     

人乳头瘤病毒11型L2NE7E6融合蛋白的原核表达及其诱发的T细胞免疫反应

目的:在原核表达系统中表达人乳头瘤病毒11型(HPV11)L2NE7E6融合蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠,检测其诱发的T细胞免疫水平,并筛选HPV11 E6、E7特异的T细胞表位肽。方法:用重叠PCR方法构建HPV11L2NE7E6融合基因并插入原核表达质粒,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达融合蛋白L2NE7E6,用SDS-PAGE和West-ern印迹鉴定融合蛋白的表达。Q柱纯化蛋白后免疫C57BL/6小鼠,分别用覆盖HPV11 E6和E7蛋白序列的肽库,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测其诱发的E7、E6特异的T细胞免疫反应,并筛选E7、E6特异的T细胞表位肽。结果:在原核表达系统中有效表达了HPV11 L2NE7E6融合蛋白,蛋白纯化后免疫C57BL/6小鼠,分别能检测到针对HPV11 E6、E7肽库刺激产生的特异性T细胞免疫反应。经肽池筛选到1条强的E6 T细胞表位肽E6aa41-55(AEI-YAYAYKNLKVVW);而E7只筛选到2条弱的T细胞表位肽,分别为E7aa53-67(QILTCCCGCDSNVRL)和E7aa73-87(DGDIRQLQDLLLGTL)。结论:HPV11 L2NE7E6融合蛋白能诱发小鼠产生E6、E7特异性细胞免疫反应,可作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白的克隆及表达

采用PCR技术从宫颈癌组织中扩增人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type16,HPV16)L1全长基因片段,目的片段克隆到pMD18T载体后经酶切鉴定及测序确认。构建重组原核表达质粒pGEX4T1-L1,转化大肠杆菌E.coliBL21,IPTG诱导表达出以非可溶性蛋白形式存在的表达蛋白,该重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的17%,免疫印迹检测表明,表达蛋白与宫颈癌病人血清出现特异性反应。成功构建了重组原核表达质粒pGEX4T1-L1,并且在原核细胞中得到表达,为进一步研究L1蛋白的免疫学活性及疫苗的研发奠定了基础。     

人乳头瘤病毒-6 L1蛋白B-细胞优势表位作为多肽疫苗的研究

本研究分析了人乳头瘤病毒-6型L1外壳蛋白之B-细胞优势表位,并拟以此为基础制作表位多肽疫苗。研究中采用Goldkey和PC／Gene软件系统综合分析HPV6之L1蛋白B-细胞优势表位后,Fmoc固相合成表位多肽,通过HPLC纯化和毛细管电泳分析其纯度。与佐剂完全乳化后,免疫小鼠,进行动物水平的免疫效果评价。取免疫小鼠血清,与HPV-6 DNA阳性的尖锐湿疣患者疣体组织上清液结合,以鉴定免疫小鼠所产生抗体的特异性。发现L1蛋白第425-439位和第486-500位具有较高的免疫原性,可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高,且该抗体与人尖锐湿疣疣体组织上清液呈阳性反应。说明所选这两个肽段为HPV6之L1蛋白的B-细胞优势表位,但诱导产生的抗体是否具有功能特异性,正在做进一步研究。     

人乳头瘤病毒-6 L1蛋白B-细胞优势表位作为多肽疫苗的研究

本研究分析了人乳头瘤病毒-6型L1外壳蛋白之B-细胞优势表位,并拟以此为基础制作表位多肽疫苗.研究中采用Goldkey和PC/Gene软件系统综合分析HPV6之L1蛋白B-细胞优势表位后,Fmoc固相合成表位多肽,通过HPLC纯化和毛细管电泳分析其纯度.与佐剂完全乳化后,免疫小鼠,进行动物水平的免疫效果评价.取免疫小鼠血清,与HPV-6 DNA阳性的尖锐湿疣患者疣体组织上清液结合,以鉴定免疫小鼠所产生抗体的特异性.发现L1蛋白第425-439位和第486-500位具有较高的免疫原性,可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高,且该抗体与人尖锐湿疣疣体组织上清液呈阳性反应.说明所选这两个肽段为HPV6之L1蛋白的B-细胞优势表位,但诱导产生的抗体是否具有功能特异性,正在做进一步研究.     

人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)的上游调控区在大肠杆菌中也具有增强子样的效应

采用痘苗病毒7.5k、11k及N2启动子,以大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-lac)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)作为标记基因,构建了大肠杆菌增强子样序列的系列检测载体。采用上述检测载体发现人乳头瘤病毒6b(Human papillomavirus type 6b,HPV-6b)上游调控区(Upstream regulating region,URR)中540bp的Sau3A-Nar Ⅰ片段,在大肠杆菌中对痘苗病毒启动子控制的CAT基因的表达有明显的增强作用,可使基因表达提高4～5倍;对β-lac基因的表达可提高3～6倍。根据这一片段的插入方向增强基因表达水平有所不同。     

乳头瘤病毒外壳蛋白的研究进展

乳头瘤病毒的外壳由Ｌ１蛋白和Ｌ２蛋白共同构成。Ｌ１是构成病毒外壳的主要成分，Ｌ２则可能与病毒ＤＮＡ的携带有关。本文就近些年关于乳头瘤病毒外壳蛋白结构与功能、病毒外壳的构建，以及病毒外壳在构建时对ＤＮＡ的包装等方面等方面的研究进展进行了综述。     

人乳头瘤病毒E6及E7蛋白研究进展

高危型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）的Ｅ６及Ｅ７蛋白是致瘤蛋白，均有锌指结构，致瘤方式都是作用于抑癌蛋白使细胞周期紊乱，Ｅ６还能激活端粒酶，使细胞不能正常凋亡，对Ｅ６及Ｅ７免疫表位的研究表明，Ｅ７及Ｅ７蛋白的鼠Ｔ细胞表位均在Ｃ端区及锌指区，但其ＨＬＡ－Ａ表位除了存在于锌指区，也存在于Ｎ端区，Ｅ６及Ｅ７蛋白的结构，功能及免疫表位的研究为防治ＨＰＶ疾病奠定了基础。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化

目的:原核表达系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,建立包涵体和可溶性表达的L1蛋白的纯化方法。方法:构建重组表达质粒p GEX-4T-1-HPV18 L1,在大肠杆菌BL21中以包涵体和可溶性方式表达HPV18 L1蛋白。通过超声波破碎菌体、洗涤包涵体、碱变性、透析复性和谷胱甘肽(GST)琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化包涵体蛋白;在菌体中加入三磷酸腺苷(ATP)和3.5 mol/L尿素孵育后,GST 4B亲和层析纯化可溶性蛋白,凝血酶酶切。SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达和纯化产物。结果:SDS-PAGE结果表明,HPV18 L1蛋白以包涵体和可溶性方式在大肠杆菌BL21内高效表达,均产生相对分子质量约为86 000的HPV18 L1-GST融合蛋白。Western印迹结果显示,包涵体纯化后获得的融合蛋白降解条带较多;而可溶性蛋白纯化后获得的融合蛋白未降解,凝血酶酶切后得到HPV18 L1蛋白,可与HPV18 L1蛋白单克隆抗体结合。结论:采用原核系统表达了HPV18 L1-GST融合蛋白,分别建立了包涵体和可溶性蛋白的纯化方法,获得HPV18 L1蛋白,为其进一步应用奠定了基础。     

人乳头瘤病毒E2蛋白及其相关疫苗

人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）感染在全球范围内颇为常见,其与肛门生殖器疣、生殖器肿瘤的发生关系密切。研究发现,乳头瘤的形成与HPVE2蛋白密不可分,该蛋白质涉及到病毒生命周期的各个阶段,与病毒的有丝分裂、其他早期蛋白的转录及细胞凋亡有关。近年来,各国学者利用E2蛋白的特性研制出E2相关疫苗,分别使用不同的重组病毒来传输E2,或是使用纯化的E2蛋白或E2融合蛋白,运输至体内的HPV转化细胞和／或HPV感染细胞中,以期达到防治HPV感染相关疾病的目的。     

重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒诱导中和抗体

为研究重组病毒样颗粒（virus-like particle,VLP)免疫血清的抗感染作用,用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的人乳头瘤病毒6型（human papillomavirus type 6,HPV-6)L1 VLP的HPV－6L1＋L2 VLP免疫BALB／c小鼠,获得抗血清,ELISA法测定抗体滴度,在细胞水平和裸鼠异源组织移植模型中评价了免疫血清的中和病毒抗感染作用。VLP诱导了高滴度（＞1：10000）的血清抗体,抗血清可以特异地阻断人胚上皮细胞对VLP的摄入,并且能抑制从尖锐湿疣活检标本提取的HPV对人上皮细胞的感染。重组HPV－6VLP免疫小鼠诱导的血清抗体具有中和病毒、抑制感染的作用。提示重组VLP可以用于研制HVP预防性疫苗。     

人乳头瘤病毒11型L1主要衣壳蛋白的B细胞表位多肽作为疫苗的研究

分析了人乳头瘤病毒11型(HPV11)L1主要衣壳蛋白的B细胞优势表位,并以此为基础研制表位多肽疫苗。研究中采用Goldkey和．PC／Gene软件系统,分析HPV11的L1主要衣壳蛋白的二级结构、抗原性、B细胞表位,并引人氨基酸抗原性指数,综合评估其B细胞优势表位。Fmoc固相合成表位多肽,高效液相层析方法纯化,毛细管电泳分析其纯度。与0．2ml佐剂完全乳化后,按50μg／只的剂量免疫小鼠,进行动物水平的免疫效果评价。取免疫小鼠血清,与HPV11 DNA阳性的尖锐湿疣患者的疣体上清液结合,鉴定免疫后小鼠所产生抗体的特异性。发现HPV11的L1主要衣壳蛋白的第426～439位和第487～501位具有较高的免疫原性,可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高,且该抗体与人尖锐湿疣的疣体组织上清液呈阳性反应。说明所选这两个肽段为HPV11的L1主要衣壳蛋白的B细胞优势表位,但是否具有功能特异性,尚需进一步研究。     

人乳头瘤病毒16型L1和L2基因表达产物的鉴定

目的:构建人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型晚期基因L1及L2的原核表达质粒,并验证目的蛋白的表达.方法:用限制性酶切及连接的方法构建原核表达质粒pET3a-16 L1和pET3a-16 L2,通过SDS-PAGE及Westen blot检测目的融合蛋白的表达.结果:在大肠菌中诱导表达的L1蛋白分子量约为57 KD,L2蛋白分子量约为90 KD.结论:该实验结果为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研制和诊断试剂的研究开发奠定了基础.     

尖锐湿疣病变的人乳头瘤病毒6型L1序列多态性分析

采用PCR方法从协和医院尖锐湿疣患者皮损中检测人乳头瘤病毒(HPV),并通过限制性片断长度多态性分析分型发现,HPV6型为主要感染型别,其次是HPV11型.根据临床特征选择主要致病型HPV6 8个分离株,扩增L1晚期基因,构建重组测序质粒,双脱氧法测序并分析L1区的核苷酸和氨基酸序列变异状况.结果表明,HPV6L1基因序列发生碱基替换的区域主要有四个区,包括SR1(5911～6104),SR2(6217～6273),SR3(6540～6661)和SR4(7062～7250).少数的碱基替换导致错义突变,推导的蛋白质一级结构中有0～3个氨基酸发生变异,但抗原性强弱与原型HPV6基本一致.     

人乳头瘤病毒6b型E7蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

进行人乳头瘤病毒6b型(Human papillomavirus type 6b,HPV6b)E7蛋白原核表达并制备其多克隆抗体。用已构建的pGEX-4T-2/HPV6bE7原核表达载体诱导表达大量可溶性融合蛋白GST-HPV6bE7,用Glutathione-Sepharose 4B亲和柱和凝血酶纯化获取HPV6b型E7蛋白。将纯化的E7蛋白免疫新西兰兔并纯化为多克隆抗体IgG。采用Western-Blot及免疫荧光法分析该抗体的效价及特异性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导3～6h后pGEX-4T-2/HPV6bE7表达载体在大肠杆菌中高水平表达可溶性融合蛋白。纯化的E7蛋白免疫新西兰兔后可获得兔多克隆抗体IgG。经Western-Blot及免疫荧光鉴定,兔抗IgG具有高效价性和抗HPV6bE7蛋白特异性。获取纯化的HPV6b型E7蛋白具有较好的免疫原性,其免疫兔产生的多克隆抗体IgG效价高,特异性好,有望进一步用于HPV6b型的生物学功能研究和免疫学效应研究。