人白介素6受体基因在痘苗病毒载体系统中的表达

人ＩＬ－６受体是一个在各种细胞上广泛表达的跨膜糖蛋白分子,是ＩＬ－６发挥细胞效应所必需的。本文通过将ＩＬ－６ＲｃＤＮＡ重组到痘苗病毒的ＴＫ基因中构建成重组痘苗病毒ＶＩＬ６Ｒ。细胞原位杂交和ＡＰＡＡＰ染色结果表明,感染ＶＩＬ６Ｒ后的Ｖｅｒｏ细胞中,ＩＬ－６Ｒ在ｍＲＮＡ和蛋白水平上均呈现较强的表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析所表达的分子量为８０ｋＤ,表明所表达的产物是糖基化的。ＩＬ－６结合试验表明,表达的膜ＩＬ－６Ｒ能够结合ｒＩＬ－６,说明它是有功能的。利用ＶＩＬ６Ｒ免疫小鼠后,能够刺激较强的抗体产生。从而为进一步研究ＩＬ－６Ｒ的信号传导和构效关系提供了基础。     

A组轮状病毒SA11VP6基因的克隆和表达

从ＳＡ１１ＶＰ６基因全序列克隆开始,设计一对两端带有酶切位点的引物,逆转录ＰＣＲ扩增出ＶＰ６全基因ＣＤＮＡ。经酶切后插入ＰＵＣ１９,构建了ＶＰ６全基因克隆ＰＲＡ６。再经酶切后插入痘苗病毒载休质凿ＰＪＳＡ１１７５中。利用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＴＫ１４３细胞,利用ＴＫ基因和Ｌａｃ基因作为重组病毒的筛选标记。表达产物用单克隆抗体ＥＬＩＳＡ法检测,发现细胞培养上清和细胞裂解液都是阳性。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂ     

鼠Ⅰ型可溶性白细胞介素1受体基因在昆虫细胞的克隆和表达

白细胞介素１（ＩＬ－１）是一种重要的细胞因子,具有广泛的生物学活性。它通过与细胞表面的白细胞介素 １受体（ＩＬ－１Ｒ）结合而起作用。以杆状病毒为载体在昆虫细胞中克隆表达了小鼠Ｉ型可溶性白细胞介素１受体（ｓＩＬ－１　ＲＩ）基因。以ＮＩＨ／３Ｔ３细胞ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到小鼠ｓＩＬ－ＩＲＩ的ｃＤＮＡ,克隆至杆状病毒转移载体ｐＡｃＧＰ６７Ｂ,将转移重组质粒与野生病毒ＡＣＮＰＶ ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,经同源重组得到重组杆状病毒ｒＡＣＮＰＶ。应用经纯化的ｒＡｃＮＰＶ感染昆虫细胞Ｓｆ９,表达获得重组的ｓＩＬ－１ＲＩ。经对亲和层析样品的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析和对ＩＬ－１β生物活性阻断作用实验证实,表达产物能够与其配基结合,并且能够分泌至细胞培养上清中。     

汉滩病毒A9株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定

为发展国产化肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒Ａ９株Ｍ基因片段为目的基因,构建转染质粒ｐＪＳＢＡ９Ｍ。以携带Ｌａｃ基因的重组病毒为亲本,使表达载体ｐＪＳＢ－Ａ９Ｍ上的Ｍ片段与痘苗病毒内的Ｌａｃ基因重组,将Ｌａｃ置换成Ａ９Ｍ片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经ＰＣＲ扩增证实Ａ９Ｍ片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的Ｖｅｒｏ Ｅ６细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体（ＨＣＯ２、     

一株新的狂犬病重组痘苗病毒某些生物学性质的研究

对表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒ＶＶＭ１１ＫＲＧ株生物学性质进行了研究,该重组病毒的特点是：（１）糖蛋白基因插入到痘苗病毒天坛株基因组ＨｉｎｄⅢＭ片段中;（２）启动子为痘苗病毒天坛株Ｐ１１晚期启动子;（３）不含外源ｌａｃ基因。该重组病毒在ＣＶ－１细胞和鸡胚细胞上繁殖滴渡略高于另一株重组痘苗病毒ＶＶＴＫ１１ＫＲＧ,在鸡胚细胞中繁殖滴度第三天达到最高,在ＣＶ－１细胞中第二天达到最高。温度稳定性与天坛株相比没有明显改变。重组病毒在家兔皮内的毒力比亲本株（天坛株）低。间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ都证明了狂犬病毒糖蛋白有良好的表达。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实糖蛋白基因准确地插入到ＨｉｎｄⅢＭ片段中。重组痘苗病毒启动子与部分糖蛋白基因克隆到ｐＧＥＭ３ｚｆ（－）质粒上,对该段ＤＮＡ序列分析表明不会产生移码和融合蛋白,从而为该重组病毒的使用提供了明确的基因背景资料。     

IL—2重组杆状病毒载体的构建及表达

将人白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ插入苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮ－ＰＶ）的转移载体ｐＶＬ１３９２中。经限制性酶切和ＤＮＡ杂交筛选、鉴定出重组转移载体ｐＶＬ１３９２－ＩＬ２。重组载体通过在昆虫细胞内共转染将ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移到野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ中。经３２Ｐ标记探针鉴定出重组病毒Ａｃ１３９２－ＩＬ２。用重组病毒感染昆虫细胞,结果表达产物有明显刺激ＣＴＬＬ细胞生长,［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入法检测ＩＬ－２活性为１５００ＩＵ／ｍ１。     

同时表达多种外源基因的非复制型重组痘苗病毒的构建

利用非复制型痘苗病毒载体,构建了能同时表达乙型肝炎（乙肝）病毒ＳＳ１、麻疹病毒ＨＡ和Ｆ及白细胞介素２（ＩＬ－２）的非复制型重组痘苗病毒ＶＩＨＩＬ２△ＣＫＳＳ１,及其相应的复制型重组豇轩病毒ＶＨＦＩＬ２ＳＳ１。这两株重组病毒在ＣＥＦ细胞上连续传至第２５代,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ,两株病毒均在Ａ２４、Ａ２７间稳定整合有ＳＳ１基因,非复制型重组病毒Ｃ、Ｋ间基因稳定缺失。经ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ     

以痘苗病毒天坛株为载体的表达单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D的重组活疫苗的建立

从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１－１６８株）病毒基因组中,分离出含有糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的１．２ｋｂ片段,插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ区的质粒ｐＪＳＢ１１７５Ｐ７．５ｋ启动子下游,转染无白血病鸡胚原代细胞,获得带有ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。在感染细胞中表达的膜抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达分子量为５４ｋＤ糖蛋白。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析了重组病毒ＤＮＡ中特异的ｇＤ基因,对作为活疫苗的重组痘苗病毒株进行了一些微生物学活性、免疫原性和毒力等方面的研究。     

表达HSV－2 gD基因的重组痘苗病毒保护小鼠对抗致死量HSV病霉攻击

利用ＰＣＲ方法对单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白Ｄ（ＨＳＶ－２ｇＤ）基因进行了修饰,在其５＇端删去约５００ｂｐ的非编码区,仅保留ＡＴＧ上游７个ｂｐ。将修饰后的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入到带有痘苗病毒天坛株ＴＫ基因区段的痘苗表达质粒ｐＪＳＡ１１７５,置于痘苗病毒Ｐ７．５ｋ早／晚期启动子控制下。将此重组质粒用脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ￣＋痘苗病毒天坛株感染的ＴＫ￣－１４３细胞,通过同源重组机制和标志基因ＬａｃＺ产物的蓝斑显色作用,以及ＢｕｄＲ试剂对ＴＫ表型的选择压力,筛选出整合有ＨＳＶ－２ｇＤ基因的重组痘苗病毒。Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交表明,ＨＳＶ－２ｇＤ基因已正确地插入痘苗病毒ＴＫ基因区内;间接免疫荧光检测显示,ＨＳＶ－２ｇＤ蛋白已得到有效表达,且主要分布于细胞膜。重组病毒免疫家兔可产生明显的抗ＨＳＶ－２ｇＤ中和抗体。用重组病毒免疫小鼠,３周后可使９４％（１７／１８）的小鼠对抗ＨＳＶ－２的致死量攻击,表明重组病毒具有明显的免疫保护作用。     

同时表达麻疹病毒L4株HA和F蛋白及人白细胞介素2(IL2)的重组痘苗病毒疫苗株的构建

构建了同时表达麻疹病毒ＬＡ株ＨＡ和Ｆ基因及人白细胞介素２（ＩＬ２）的重组痘苗病毒疫苗株ＲＶＪＭＬＨＡＦＫＩＬ２。Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ结果显示,ＨＡ、Ｆ和人ＩＬ２基因均在痘苗病毒中稳定有效表达,且产物与天然蛋白相近。ＨＡ分子有糖化的７９ｋＤ和非糖化的田ｋＤ两种形式;Ｆ分子以６０ｋＤ的前体Ｆ０、４３ｋＤ的Ｆ１和１８ｋＤ的Ｆ２三种形式存在。表达产物的血凝效价为１：８,血溶活性ＯＤ５４０的测定结果是Ｏ３７。该重组病毒免疫新西兰白兔及Ｃ５７小鼠,可以产生抗麻诊病毒ＨＡ和Ｆ蛋白的特异性ＥＬＩＳＡ（１：６４４～１６００）、血凝抑制（１：２５６～５１２）、血溶抑制（１：８０～１６０）和ＮＴ（１：６４０）抗体。接种兔及裸鼠后的毒力反应,明显低于只表达ＩＬ２的重组痘苗病毒疫苗株ＲＶＪ１２３,表现为兔皮肤红肿范围小,持续时间短,皮肤无坏死;裸鼠毒力的结果,表现出ＲＶＪＭＬＨＡＦＫＩＬ２病毒只存留于接种局部,而且滴度大大降低,未发现该病毒向其它脏器播散和增殖。麻疹重组痘苗病毒疫苗株的构建为该疫苗株的人体免疫观察奠定了基础。     

鼠I型可溶性白细胞介素1受体基因在昆虫细胞的克隆和表达

白细胞介素１（ＩＬ－１）是一种重要的细胞因子,具有广泛的生物学活性。它通过与细胞表面的白细胞介素１受体（ＩＬ－１Ｒ）结合而起作用,以杆状病毒为载体在昆虫细胞中克隆表达了小鼠Ｉ型可溶性白细胞介素１受体基因,以ＮＩＨ／３Ｔ３细胞ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到小鼠ｓＩＬ－１ＲＩ的ｃＤＮＡ,克隆至杆状病毒转移载体ｐＡｃＧＰ６７Ｂ,将转移重组质粒与野生病毒ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,     

重组家蚕病毒表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

将传染性囊病病毒ＨＺ９６株主要宿主保护性抗原ＶＰ２的ｃＤＮＡ基因克隆到杆状病毒转移载体ｐＢａｃ－ＰＡＫ８中,获得重组转移载体ｐＢａｃＰＡＫ－ＶＰ２,载体ｐＢａｃＰＡＫ－ＶＰ２与修饰病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ６线性化基因组ＤＮＡ共转染单层家蚕Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｂｍ）Ｎ细胞,经细胞内同源重组,筛选到重组病毒。ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫鲩迹结果表明,ＶＰ２在家蚕培养细胞和家蚕幼虫中均得到了表达。     

痘苗病毒天坛株非必需区TA25R…TA36L的两步重组表达载体的构建

针对痘苗病毒天坛株非必需区ＴＡ２５Ｒ－ＴＡ３６Ｌ,构建了可去除ＴＡ２６Ｒ至ＴＡ３５Ｌ的１０个ＯＲＦｓ,并同时表达ＬａｃＺ的两步重组表达载体ｐＡ２４２７ＬａｃＺ。通过两种方法（一步重组和两步重组）获得了在该区域表达ＬａｃＺ基因的重组痘苗病毒ＲＶＡ２４２７Ｌdisplay status     

A组轮状病毒我国地方株VP6基因的序列测定及其在杆状病毒系统中的表达

通过反转录－ 聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ） 获得了轮状病毒地方株 Ｔ１１４ Ｖ Ｐ６ 全基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段,将其克隆入转移载体质粒ｐ Ｖ Ｌ１３９３ 中,构建成重组质粒ｐ Ｖ Ｌ１３９３ － Ｖ Ｐ６ 。对克隆的 Ｖ Ｐ６ 基因进行序列测定,并用它和杆状病毒（ Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ） 野毒株 Ｄ Ｎ Ａ 共转染 Ｓｆ９ 细胞,筛选纯化得到含 Ｖ Ｐ６ 基因插入片段的重组杆状病毒,并进行了表达重组蛋白 Ｖ Ｐ６ 的检测。测序结果显示 Ｖ Ｐ６ 基因全长１ ３５６ｂｐ ,序列分析显示与 Ｗａ 株非常接近,提示 Ｔ１１４ 为亚组Ⅱ病毒株。用高价免疫血清经 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测表达产物,结果显示,重组病毒感染细胞裂解液样品中可见大小约４５ｋ Ｄ 的特异条带;亚组Ⅱ特异性单抗检测到大小约１２０ｋ Ｄ 的条带,提示重组蛋白 Ｖ Ｐ６ 获得了表达,具有正常的抗原反应性和天然 Ｖ Ｐ６ 的三体结构。     

人癌胚抗原-重组痘苗病毒的构建和制备

痘苗病毒的基因组庞大,结构复杂而特殊,不可能将外源基因直接插入它的基因组,必须利用一种特殊的痘苗病毒质粒,才能构建成功重组痘苗病毒．在分析了痘苗病毒质粒ｐＪ１２０〔含有我国天花疫苗－痘苗病毒天坛株７６１的启动子和胸苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ,简称ＴＫ基因）,及含有人癌胚抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ,简称ＣＥＡ）ｃＤＮＡ全序列的质粒ｐ９１０２３Ｂ－ｃｅａ－１７结构的基础上,设计出三步法构建了重组疫苗病毒质粒ｐＪ－ＣＥＡ．经酶切及ＰＣＲ鉴定ｐＪ－ＣＥＡ中ＣＥＡｃＤ－ＮＡ的存在,进一步用同源重组方法构建了表达人ＣＥＡ的重组痘苗病毒,并以人体成纤维细胞作为宿主细胞,对ＣＥＡ－重组痘苗病毒进行了大量培养．再次证实痘苗病毒是良好的真核表达载体,可以高效而准确地表达细胞膜糖蛋白ＣＥＡ．     

重组腺病毒介导的白细胞介素—12（IL—12）在肝癌细胞中的表达

利用腺病毒表达系统在肝癌细胞中成功地表达了有生物活性的白细胞介素－１２（ＩＬ－１２）。ＩＬ－１２的Ｐ３５和Ｐ４０ ｃＤＮＡ分别克隆到腺病毒载体ｐＡＣＣＭＶ．ｐＬｐＡ,构建ｐＡＣ／Ｐ３５和ｐＡＣ／Ｐ４０表面质粒。与腺病毒重组质粒ｐＪＭ１７共转染２９３细胞,通过基因重组产生ＩＬ－１２Ｐ３５和Ｐ４０重组腺病毒。用重组腺病毒感染肝癌细胞株ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ７７２１,经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ检测证明,     

应用痘苗病毒为载体表达人白细胞介素4的研究

在真核细胞中表达近似于人类天然糖基化的白细胞介素４（ｈＩＬ－４）,为重要的研究课题。利用基因工程技术,以痘苗病毒作为载体,使之在真核细胞中表达ｈＩＬ－４,为生产糖基化的ｈＩＬ－４开辟新的可能途径。在痘苗病毒表达载体ｐＪ１２０质粒的基础上,组建了含有ｈＩＬ－４基因的ｐＪｌ２０／ｈＩＬ－４重组质粒,该质粒以痘苗病毒的胸腺嘧啶核苷激酶（ＴＫ）基因为侧翼序列,中间插入痘苗病毒的Ｐ１１和Ｐ２５两个转录方向相反的启动子,Ｐ２５的下游连接β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）基因,ｈＩＬ－４基因在痘苗病毒启动子Ｐ１１控制下进行表达,将ＰＪ１２０／ｈＩＬ－４质粒ＤＮＡ用脂质体转染法导入ＴＫ阴性的骨髓瘤细胞（ＴＫ１４３细胞）,与预先感染的痘苗病毒在细胞内进行同源序列重组,并且用病毒的核酸杂交鉴定证实,ｈＩＬ－４基因已重组到痘苗病毒基因组中,用ｈＩＬ－４应答细胞株检测病毒感染细胞上清,发现重组病毒感染的细胞上清中含有高滴度的ｈＩＬ－４活性,并对此种情况下ｈＩＬ－４产生的条件进行了动态观察。     

以痘苗病毒天坛株为载体的表达单纯疱疹病毒I型糖蛋白D的重组活疫苗…

从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ｉ型病毒基因组中,分离出含有糖蛋白Ｄ基因的１．２ｋｂ片估,插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ区的持粒ｐＪＳＢ１１７５Ｐ７．５ｋ启动子下游,转染无白血病鸡胚原供细胞,获得带有ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。     

重组人白介素6受体功能区片段的功能鉴定

用生物素标记重组人白介素６受体功能区片段ｒＩＬ６Ｒ－２８及其二联体蛋白ｒＩＬ６Ｒ－５３,竞争ＥＬＩＳＡ表明重组蛋白可以与配基ＩＬ－６特异结合,流式细胞术检测结果表明ＩＬ－６与生物素标记的重组蛋白所形成的复合物能够与７ＴＤ１细胞表面的ｇｐ１３０结合,而７ＴＤ１细胞生长分析则表明,重组蛋白可以增强ＩＬ－６对７ＴＤ１细胞的生长刺激作用。     

转基因人肺腺癌细胞株的建立

以逆转录病毒ｐＬＸＳＬ为载体与人细胞介素２基因（ＩＬ－２）重组,用电穿孔技术将其重组子ｐＬＩＬ—２ＳＮ导入ＰＡ３１７细胞中,建立了逆转染病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ—２ＳＮ。应用逆转录病毒包装体系细胞上清液去转染入肺腺癌细胞ＳＰＣ—Ａ１,经过２０天含Ｇ４１８培液的筛选式培养,历经了５０代的传代培养,获得了转白细胞介素２基因的人肺腺癌细胞株ＳＰＣ－Ａ１／ＩＬ－２。该细胞（ＳＰＣ－Ａ１／ＩＬ－２）经ＰＣＲ技术验证外源性目的基因（ＩＬ－２ｇｅｎｅ）导入细胞内,且证明该细胞能表达ＩＬ—２基因（有ＩＬ－２的分泌）。我们研究的目的是对肿瘤细胞的特异性抗原修饰、对肿瘤细胞进行处理。试图建立肿瘤疫苗。