受MeJA诱导的烟草GTs基因启动子的克隆及转化

中南民族大学生命科学学院生物技术国家民委重点实验室袁磊。刘学群。王春台利用已克隆的1个甲基茉莉酸（MeJA）诱导的糖基转移酶（GTs）基因,以PCR扩增得到该基因启动子序列,其长度约为1．4kb。用改造后的双元载体pCAMBIA1301与GTs基因启动子连接,构建了含目的启动子与GUS基因的融合基因质粒pCAP—GUS,通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草W38后,     

除虫菊TcALDH和TcGLIP基因启动子克隆及功能分析

天然除虫菊酯是从除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)中提取的绿色植物源生物杀虫剂。醛脱氢酶(TcALDH)和GDSL脂肪酶(TcGLIP)是除虫菊酯生物合成途径中的关键限速酶。为探究TcALDH和TcGLIP基因的功能,该研究从除虫菊无性系‘W99''中克隆得到TcALDH和TcGLIP基因的启动子,并通过生物信息学分析、组织化学染色(GUS染色)、荧光素酶报告实验和外源植物激素处理实验对其启动子的调控元件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性进行分析。结果表明:(1)克隆得到的TcALDH和TcGLIP启动子序列分别为2 848、1 343 bp,均含有多个与逆境应答和激素信号相关的顺式作用元件。(2)分别构建了启动子和荧光素酶融合的植物表达载体,在烟草叶片中观察荧光成像发现,TcALDH启动子具有茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)激素诱导特异性。(3)用MeJA和ABA处理除虫菊‘W99''组培苗发现,TcALDH的表达量在12 h内受ABA诱导时上调,受MeJA诱导时先升高后降低,TcGLIP的表达量受ABA和MeJA诱导下调。(4)分别构建了TcALDH和TcGLIP启动子与GUS基因融合的植物表达载体,转化烟草并对其转基因叶片进行GUS活性染色发现,TcALDH启动子在烟草叶片腺体、腺毛头部及叶肉细胞中表达,而TcGLIP启动子仅在烟草叶肉细胞中表达。综上认为,TcALDH和TcGLIP的启动子具有组织特异性,TcALDH启动子具有MeJA和ABA激素诱导特性。该研究结果为除虫菊TcALDH和TcGLIP基因参与除虫菊酯合成的调控机制提供了新见解。     

苹果果实β-半乳糖苷酶基因启动子的克隆与功能分析

根据已发表的苹果基因组序列设计特异引物,克隆得到苹果品种‘嘎拉’中β-半乳糖苷酶基因(Md-gal)的启动子。序列分析表明,该启动子除含有大多数高等植物启动子具有的保守元件外,还含有大量光响应元件和与激素相关的顺式作用元件,主要有赤霉素响应元件(GARE-motif和P-box)、茉莉酸甲酯(MeJA)应答元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)和生长素响应元件(TGA-element);构建5个不同长度Md-gal启动子和GUS基因融合的瞬时表达载体,并进行苹果果实和烟草叶片转化试验,结果显示,5个启动子均具有启动子活性,在Md-gal启动子序列中激活与抑制调节元件并存,正调控元件位于-1206~-754bp区域,负调控元件位于-754~-597bp区域;对Md-gal启动子进行激素响应分析结果显示,激素处理可对其产生诱导作用,且MeJA处理后GUS活性最高。研究表明,Md-gal启动子具有真核基因启动子的基本结构特征和正负调控特性,可响应外源激素处理,可能在苹果果实生长发育和成熟软化方面具有一定的作用。     

拟南芥冷诱导型启动子CBF 3的克隆及活性检测

目的：构建冷诱导型启动子CBF3基因的植物表达载体,并将其转入烟草。方法：以拟南芥基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆冷诱导表达启动子CBF3（C-repeat binding factor）。用CBF3启动子替换pBI121载体上的35S启动子构建新的载体pBC-GUS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草。结果：获得了转基因烟草,转基因烟草的GUS组织化学染色及PCR分析结果表明,在低温诱导下,CBF3启动子可增强GUS基因表达。结论：CBF3启动子可应用于植物抗冷基因工程研究。     

天麻抗真菌蛋白基因的克隆及其启动子活性

通过构建和筛选天麻(Gastrodia elata Bl.)基因组文库,克隆了一个天麻抗真菌蛋白基因组DNA.该基因组DNA含有一个516碱基组成的编码区,没有内含子结构.其启动子区含有保守的TATA盒及CAAT盒.为研究启动子活性,构建了-1 157 bp启动子区与GUS基因的融合表达载体.并将其用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化方法导入烟草(Nicotiana tabacum)中,获得了稳定转化的烟草.利用荧光检测及组织化学染色法对GUS表达进行了分析.结果表明,该启动子能够启动GUS基因在转基因烟草中组织特异性地表达.GUS基因在根中的表达水平最高,茎中次之,叶中只有低水平表达.而且该启动子具有诱导表达活性,可被真菌及水杨酸、茉莉酸强烈诱导表达.     

拟南芥生长素受体基因TIR1启动子的初步分析

以野生型拟南芥（Arabidopsis Columbia）基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到拟南芥生长素受体基因T1R1启动子的5个不同长度的系列缺失片段,将这些片断分别克隆到PGM—T载体上。序列分析表明,该启动子系列缺失片段的大小分别为2008bp、1524bp、939bp、532bp和321bp。与已报道的序列完全相同。将不同长度的启动子克隆片断分别与GUS基因融合,构建成表达载体后,在烟草叶片中作遗传转化。分析结果显示：不同长度的启动子片段已整合到烟草基因组中并有GUS酶活性存在,且不同长度启动子片段的表达活性有较明显差异。     

水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建及转化研究

利用PCR方法从水稻叶绿体基因组DNA中分离16S启动子,并在其下游加入rbcL基因SD序列,以增强该启动子的翻译能力;序列分析表明,除加入的SD序列外,扩增片段与水稻(Oryza sativa)叶绿体基因组DNA序列16S启动子相应区域同源性为100％。将16S启动子与bar基因和gfp基因的融合基因连接,以psbA基因的3′序列为终止子,并以烟草叶绿体trnH—psbA和trnK为同源片段构建了烟草叶绿体表达载体pRl6S。用基因枪转化烟草,转化植株经Southern、Northern检测及后代遗传学分析,发现：16S启动子具有启动活性,融合基因已在烟草叶绿体中稳定整合并遵循母系遗传规律。     

天麻抗真菌蛋白基因的克隆及其启动子活性

通过构建和筛选天麻（Gastrodia elata Bl)基因组文库,克隆了一个天麻抗真菌蛋白基因组DNA。该基因组DNA含有一个516碱基组成的编码区。没有内含子结构。其启动子区含有保守的TATA盒及CAAT盒。为研究启动子活性。构建了-1157bp启动子区与GUS基因的融合表达载体。并将其用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化方法导入烟草（Nicotiana tabacum)中,获得了稳定转化的烟草。利用荧光检测及组织化学染色法对GUS表达进行了分析。结果表明,该启动子能够启动GUS基因在转基因烟草中组织特异性地表达。GUS基因在根中的表达水平最高。茎中次之,叶中只有低水平表达,而且该启动子具有诱导表达活性。可被真菌及水杨酸,茉莉酸强烈诱导表达。     

SZZ-Harpin融合蛋白在苏云金芽孢杆菌中的表达及活性测定*

PCR扩增编码SZZ短肽与植物过敏素 (harpin)融合蛋白的 1 5kb基因片段 ,克隆到苏云金杆菌 (^{Bacillusthuringiensis} ,Bt)表达载体pHZB1上 ,并置于晶体蛋白cry1类基因的启动子下游 ,从而构建表达质粒pHSZH。将表达载体pHSZH电激转化晶体缺陷型的BtK CryB菌株 ,获得工程菌Bt pHSZH。SDS PAGE蛋白分析和生物测定结果显示 ,培养 4 8h的Bt pH SZH明显表达SZZ Harpin融合蛋白 ,表达产物具有诱导烟草     

SZZ—Harpin融合蛋白在苏云金芽孢杆菌中的表达及活性测定

PCR扩增编码SZZ短肽与植物过敏素(harpin)融合蛋白的1．5kb基因片段,克隆到苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)表达载体pHZB1上,并置于晶体蛋白cry1类基因的启动子下游,从而构建表达质粒pHSZH。将表达载体pHSZH电激转化晶体缺陷型的BG—CDB菌株,获得工程菌Bt-pHSZH。SDS-PAGE蛋白分析和生物测定结果显示,培养48h的Bt-pHSZH明显表达SZZ-Harpin融合蛋白,表达产物具有诱导烟草过敏反应和系统性获得抗性的功能。     

拟南芥生长素受体基因TIR1启动子的克隆及序列分析

以野生型拟南芥 (Arabidopsis Columbia)基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到拟南芥生长素受体基因TIR1启动子2008片段,将该片断克隆到PGM-T载体上.序列分析表明,该启动子大小为2008bp,RNA聚合酶识别序列TATA-box,TIR1特异表达和增强序列CAAT-box皆完整,与已报道的序列比较仅有3个核苷酸发生改变,同源性为99.85%.将该启动子与GUS基因融合,构建成表达载体后,在拟南芥和烟草叶片中做瞬时表达,结果分析显示:拟南芥和烟草叶片中均有GUS 酶活性存在.     

玉米逆境诱导型启动子克隆及其植物表达载体构建

设计特异引物,利用PCR方法从玉米(Zea mays)基因组DNA中克隆低温和盐相应蛋白(low temperature andsalt responsive protein,LS)基因上游1 735 bp,命名为Lsp。利用在线启动子预测工具PlantCARE分析表明,序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还包含各种胁迫响应元件。以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将克隆得到的启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体pCAM-Lsp,并用反复冻融法将其导入农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法转化烟草,GUS组织化学染色显示出Lsp驱动GUS基因表达。结果表明,该Lsp启动子片段具备一定的启动活性,为探明玉米逆境胁迫启动子表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。     

‘赤霞珠’葡萄Vv5GT3基因启动子的克隆及其对光照的响应

本研究利用PCR技术从’赤霞珠’葡萄(Vitis vinifera L.cv Cabernet Sauvignon)基因组DNA中扩增得到与花色素3,5-O-双葡萄糖苷合成相关的Vv5GT3基因的启动子。对启动子序列的顺式作用元件进行预测分析发现,Vv5GT3基因的启动子序列除了含有植物启动子的基本结构元件外,还有多个与胁迫和激素诱导相关的顺势调控元件。以荧光素酶基因(Luc)作为为报告基因,构建了Vv5GT3基因启动子的植物表达载体p CAMBIA1300-Vv5GT3 promoter。以根癌农杆菌GV3101感受态细胞为受体,转化植物融合表达载体进行瞬时表达,并对启动子进行了功能活性分析,结果表明该启动子能够驱动Luc报告基因在烟草叶片组织中表达。用不同的光照条件处理被农杆菌侵染的烟草叶片,结果显示长时间光照有利于启动子的激活,而遮光减弱了Vv5GT3启动子的活性。     

烟草病程相关蛋白基因启动子的克隆及序列分析

在植物的防御反应中,会诱导产生一些宿主编码的蛋白,叫做病程相关蛋白。该文通过PCR扩增,从烟草(Nicotiana tobacwn ce.Samsun)中克隆了水扬酸诱导表达的PR—1a基因的两个启动子TP12及TP13。以期用于构建诱导表达基因敲除系统,并用于无性繁殖植物的无标记基因转化。序列分析表明,启动子TP12含1313个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为98．6％;TP13含654个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99．4％。     

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟草种子中的表达

以玉米(Zea mays L.)黄化苗为材料,利用PCR技术扩增了玉米19kDa醇溶贮藏蛋白基因(zein)起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的-1～-694片段具有19kDa zein启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达90％以上。将此启动子插入pPKGT的GUS基因及NOS终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草(Nicotiana tabaccum Var.samsum),得到了转化植株。转化的烟草的PCR扩增及Southern杂交证明目的片段已整合到烟草基因组中。转基因植株的GUS活性检测表明,在叶、根中无GUS活性,GUS活性只存在于种子中。转基因植株烟草种子经冷冻切片,GUS底物Xgluc活体组织染色证明GUS活性只存在一层介于种子胚乳与种皮之间的细胞中。     

拟南芥根特异表达基因启动子在烟草中的表达

以拟南芥为材料,利用PCR技术分离pyk10启动子序列,构建了该启动子GUS植物表达载体,农杆菌介导转化烟草,分析该基因在烟草中的表达,以明确拟南芥根特异表达基因pyk10启动子在烟草中的表达特性.结果表明:克隆的pyk10启动子与已报道的pyk10启动子一致性为100%,GUS基因在烟草的根部特异表达,表明该启动子为根部特异表达启动子,为揭示植物根的发生、分化和发育机制,以及培育抗根部病虫害和营养高效利用型转基因烟草奠定了基础.     

糙皮侧耳Pleurotus ostreatus子实体凝集素基因polectin2及其启动子的克隆及功能鉴定

凝集素在食用菌的生长发育、抗病虫等逆境及抗肿瘤等方面发挥着重要的作用,但是关于糙皮侧耳凝集素基因的抗逆功能研究还比较薄弱。因此,本文利用PCR技术克隆得到糙皮侧耳子实体凝集素polectin2基因及其启动子序列,测序和生物信息学结果显示该基因不含内含子,完整开放阅读框为408bp,编码136个氨基酸,预测蛋白分子量15.3k Da;启动子polectinpro序列长度为927bp,生物数据库PLACE分析结果表明polectinpro含有低温、干旱胁迫诱导和病程相关等抗逆元件。然后,构建含有GFP融合蛋白的重组植物表达载体pCAMBIA1302-polectinpro-gfp,并进行烟草遗传转化,结果证明该启动子能够在低温诱导下驱动gfp基因表达。同时成功构建了含有polectin2的重组植物表达载体pCAMBIA1301-polectin2并进行了烟草遗传转化;对阳性转化植株T1代和野生型种子进行低温胁迫实验,结果表明转基因种子萌发率明显高于野生型。综上所述,推测polectin2基因具有耐低温功能,且其启动子具有低温诱导活性。上述结果为进一步利用子实体凝集素polectin2基因提高食用菌的耐低温等抗逆功能提供了理论依据和技术支持。     

草酸氧化酶基因转化烟草的研究

为研究草酸氧化酶基因(OxO)对植物抗病的作用,将含有CaMV 35s启动子的植物表达载体以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘方法,转化了烟草97131。具有卡那霉素抗性的再生植株经PCR检测,得到了与阳性对照一致的470bp的片段,进一步对PCR产物测序表明OxO基因已整合进烟草基因组中。在对草酸的耐受性实验中,转基因烟草对草酸的抗性明显高于未转化烟草。     

水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建及转化研究

利用PCR方法从水稻叶绿体基因组DNA中分离16S启动子, 并在其下游加入rbcL基因SD序列,以增强该启动子的翻译能力;序列分析表明, 除加入的SD序列外, 扩增片段与水稻（Oryza sativa）叶绿体基因组DNA序列16S启动子相应区域同源性为100%。将16S启动子与bar基因和gfp基因的融合基因连接,以psbA基因的3′序列为终止子, 并以烟草叶绿体trnH-psbA和trnK为同源片段构建了烟草叶绿体表达载体pR16S。 用基因枪转化烟草, 转化植株经Southern、Northern检测及后代遗传学分析, 发现16S启动子具有启动活性, 融合基因已在烟草叶绿体中稳定整合并遵循母系遗传规律。     

油葵种子特异启动子Ha ds10 G1的克隆及功能鉴定

从油葵中克隆得到LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因的启动子序列,并对其进行功能分析。利用PCR技术从油葵品种"矮大头"基因组DNA中分离Ha ds10 G1基因上游的调控序列,将其与GUS基因融合,构建种子特异性表达载体p BI121-PHa ds10,通过根癌农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89,对再生植株进行PCR、RT-PCR和GUS组织化学分析,以检测GUS基因在转基因烟草中的表达情况。结果表明,油葵Ha ds10 G1基因启动子长度为1 417 bp,与已报道的向日葵Ha ds10G1基因启动子序列同源性为89.42%。作用元件分析发现该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如RY重复元件、ABRE元件、TC-rich元件等。转基因植株的PCR结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,该启动子序列仅能够驱动GUS基因在烟草种子表达,而在根、茎、叶等组织中均未检测到GUS基因表达。因此,油葵LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因上游1 417 bp片段具有种子特异性启动子功能。研究结果为油葵等油料作物的油脂遗传改良提供组织特异性启动子。