丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的比较

为获得丙型肝炎病毒的核心蛋白（Core）,将克隆有Core基因的表达载体pBVIL1-Core转化大肠杆菌HB101,温度诱导表达Core蛋白。同时利用PCR方法以含有丙型肝炎病毒全基因的质粒PBR^TM／HCV为模板扩增Core基因,克隆进表达载体pPICZαA,构建表达载体pPICZαA-Core,转化毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,在甲醇诱导下表达Core蛋白。Western-blot显示Core蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白量占菌体总蛋白的20％;在酵母培养上清中存在Core蛋白,证明Core蛋白在酵母系统中成功表达。     

辣根过氧化物酶同工酶C基因在巴斯德毕赤酵母中的克隆与鉴定

目的：克隆辣根过氧化物酶同工酶C基因,为此基因的表达作准备。方法：用PCR方法从辣根的总DNA中扩增得到一种辣根过氧化物酶同工酶C基因HRPC2,通过PCR的方法去除内含子后连接到pMD18-T载体上,测序证明正确后,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒pC2EX9K。再将辣根过氧化物酶同工酶C基因在毕赤酵母中进行克隆、鉴定。结果：重组质粒pC2EX9K转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论：应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HRPC2。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的比较*

为获得丙型肝炎病毒的核心蛋白(Core),将克隆有Core基因的表达载体pBVIL1-Core转化大肠杆菌HB101,温度诱导表达Core蛋白。同时利用PCR方法以含有丙型肝炎病毒全基因的质粒PBRTM/HCV为模板扩增Core基因,克隆进表达载体pPICZαA,构建表达载体pPICZαA-Core,转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,在甲醇诱导下表达Core蛋白。Western-blot显示Core蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白量占菌体总蛋白的20%;在酵母培养上清     

辣根过氧化物酶同功酶C3基因在毕赤酵母中的表达

目的：克隆与表达辣根过氧化物酶同功酶C3（HRPC3）基因。方法：用PCR方法从辣根的总DNA中,扩增得到一种辣根过氧化物酶同功酶C3基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上,测序证明正确后,再将目的基因正确插入到巴斯德毕赤酶母表达载体pPIC9K中,含有目的基因的重组pPIC9K质粒在毕赤酶母中进行表达与分析。结果：应用毕赤酶母作为受体菌,成功表达了HRPC3基因,其活性为56IU/L。结论：毕赤酶母直接表达出了具有生物活性的辣根过氧化物酶同功酶C3。     

乙型肝炎病毒包膜M蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

转化了乙肝病毒 preS2 S基因的重组巴斯德毕赤酵母菌株经甘油培养基充分增殖 ,然后转移到甲醇培养基中进行诱导表达。破碎细胞并提取胞内蛋白 ,经ELISA和WesternBlot检测 ,证明有 4株GS1 1 5 /HIS MUT 表达了HBVM蛋白。     

新发现的丙型肝炎病毒核心蛋白

近年来,有关新的丙型肝炎病毒核心基因及其编码产物的研究时有报道.与丙型肝炎病毒传统单一阅读框架翻译的病毒蛋白不同,新的核心C蛋白是由该病毒核心蛋白基因阅读框架序列+1移位后翻译产生的.新型C蛋白普遍存在于各个丙型肝炎病毒基因型中,约40%及 20%病毒感染者体内可检测到针对新型C蛋白的抗体和细胞免疫反应.在丙型肝炎病毒感染所致的肝癌患者中,新型C蛋白的表达量增高.新型C蛋白被认为可能与HCV感染慢性化和肝癌有关.     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的原核表达系统,获得高产量的纯化核心蛋白。方法：应用多聚酶链反应(PCR),以HCV—H株全长cDNA序列为模板,扩增获得核心区基因片段,克隆入原核表达载体pBVIL1,构建原核表达载体pBVIL1-C,转化HB101宿主菌,通过温度诱导表达核心蛋白。结果：扩增得到目的基因长度为573bp,构建pBVIL1-C表达载体,在HB101宿主菌中通过温度诱导获得稳定表达,表达蛋白占菌体总蛋白含量的21％,Western—Blot检测证实表达产物可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应。结论：HCV核心蛋白可在大肠杆菌中获得高表达并具有良好的反应原性。     

丙型肝炎病毒核心蛋白结构及功能研究进展

大量研究结果表明丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白是多功能蛋白质,它可能与ＨＣＶ致病（癌）有密切关系。本文简述近年来关于核心蛋白结构与功能的最新进展。并初步探讨了ＨＣＶ核心蛋白可能的致病机制。     

丙型肝炎病毒核心蛋白与慢性感染

丙型肝炎病毒感染后极易造成肝脏组织的慢性化改变,随着对丙型肝炎病毒核心蛋白的深入研究,发现核心蛋白是一种重要的调节蛋白,在病毒慢性感染方面有重要作用。本文就两者之间的关系进行阐述。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆与表达

以含有丙型肝炎病毒核心蛋白基因的质粒pJLA502-C为模板,用PCR方法重新扩增克隆了核心蛋白基因,在扩增基因的上下端分别增加了NCOⅠ及SalⅠ酶切位点。将克隆的基因酶切后插入表达载体pBV221内,转化大肠肝菌DH_(5α),获得表达非融合核心蛋白的工程菌,42℃热诱导5hr,表达蛋白占菌体蛋白总量的15％。经包涵体纯化及分子筛纯化等,获得核心蛋白,经ELISA及Western Blotting分析表明有较好的抗原性和特异性。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。     

mMR-1基因的克隆和在毕赤酵母中分泌表达

hMR-1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT-PCR技术从小鼠C57BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR-1基因 (mMR-1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR-1基因 (hMR-1)同源性为 90.1%。构建表达载体pPIC9 mMR-1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR-1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 25kD ,诱导 5d时产量达到 50mg/L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR-1的生物学功能奠定了基础。     

酸性木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

运用“鸟枪法”克隆构建了环境微生物的基因组文库,并从中筛选得到一个酸性木聚糖酶基因,命名为xyl3,其在GenBank中的登录号为gb：AY300805。BLAST分析表明,该基因的序列同源性很低,其中仅存在很短的木聚糖酶基因的同源片段,其编码的木聚糖酶属于Glycosyl hydrolases family 10,与来源于Geobacillus stearothermophilus的intra—cellular xylanase在氨基酸水平具77％同源性。该基因经T4 DNA polymerase处理后,克隆至经限制性内切酶CpoⅠ和NotⅠ双酶切后的毕赤酵母表达载体pHBM905,获得重组质粒pHBM706。此重组质粒转化毕赤酵母GS115,经含有交联木聚糖的选择性培养平板和PCR扩增鉴定筛选得到重组毕赤酵母GS115（pHBM706）。以0．5％甲醇于28℃诱导产酶,测得重组毕赤酵母GS115（pHBM706）在诱导的第36h产酶达最高值,所产粗酶液酶活为0．177IU／mL。该酶的最适反应pH为5．5,最适反应温度为50℃。     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3基因在毕赤酵母中的表达及分析

旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达.将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-EtCDPK3.重组质粒通过电击转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞.重组酵母细胞在含1％甲醇的BMMY培养基中诱导产生目的蛋白,培养收集1-4d的部分上清.经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为49 kD.Western blotting表明,该蛋白能与兔抗EtCDPK3血清特异性结合.结果表明,柔嫩艾美耳球虫CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达.     

毕赤酵母优化表达外源蛋白策略

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种异源蛋白表达的理想系统,但目前并非所有的外源蛋白都能在毕赤酵母中成功高效表达,不同的蛋白表现为不同表达水平、生物活性及稳定性。从遗传因素和表达条件综述了外源蛋白在毕赤酵母中的优化表达策略。     

ATF-PAI2CD融合蛋白基因在毕赤酵母中克隆、表达和鉴定

为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物 2型(PAI 2 )突变体所构成的融合蛋白基因 ,并在Pichiapastoris中表达 ,应用PCR获得了人ATF PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF PAI2CD) ,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K ,获得融合基因表达质粒pZWY ATF PAI2CD .该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,然后用甲醇诱导表达 .工程菌用摇瓶发酵 ,表达产物ATF PAI2CD占培养液中总蛋白 5 0 %以上 .经硫酸铵沉淀、分子筛和离子交换层析纯化得到的目标表达产物纯度达 95 % .Western印迹检测具有PAI 2与uPA的免疫原性 ,经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 .经流式细胞仪 (FCM )检测 ,能与肿瘤细胞特异性结合 .结果表明 ,ATF PAI2CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达 ,且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能 .提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景 .